Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

تم دعم نشر هذا الفيديو من قبل My CytoHealth Sdn. Bhd.

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري والثقافة
<ol><li>استزراع hUC-MSCs بكثافة بذر 5 × 103 / سم2 في DMEM ، مكملة ب 8٪ تحلل الصفائح الدموية الب?...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

EVs هي واحدة من المجموعات الفرعية المهمة للإفراز في MSCs التي تلعب دورا حاسما أثناء العمليات الطبيعية والمرضية. ومع ذلك ، فقد ارتفعت sEVs ، التي يتراوح حجمها بين 30 إلى 200 نانومتر ، كأداة محتملة للعلاج الخالي من الخلايا في العقد الماضي. تم تطوير تقنيات مختلفة لعزل المركبات الكهربائية من MSCs. ومع ذل...

وفقا ل MISEV 2018 ، فإن sEVs عبارة عن جسيمات ثنائية الطبقة دهنية غير قابلة للتكرار مع عدم وجود نواة وظيفية ، بحجم 30-200 نانومتر1. تحتوي sEVs المشتقة من MSC على جزيئات إشارات مهمة تلعب أدوارا مهمة في تجديد الأنسجة ، مثل microRNA أو السيتوكينات أو البروتينات. لقد أصبحوا بشكل متزايد "نقطة ساخنة" بحثية في الطب التجديدي والعلاج الخالي من الخلايا. أظهرت العديد من الدراسات أن sEVs المشتقة من MSC فعالة مثل MSCs في علاج الحالات المختلفة ، مثل التعديل المناعي2،3،4،5 ، وتعزيز تكوين العظم6 ، ومرض السكري7،8 ، أو تجديد الأوعية الدموية9،10. مع تقدم تجارب المرحلة المبكرة ، تم تسليط الضوء على ثلاث قضايا رئيسية رئيسية فيما يتعلق بالترجمة السريرية ل MSCs-EVs: إنتاجية EVs ، ونقاء EVs (خالية من حطام الخلايا والملوثات البيولوجية الأخرى مثل البروتين والسيتوكينات) ، وسلامة غشاء الطبقة المزدوجة الفوسفوليبيد للمركبات الكهربائية بعد العزل.
تم تطوير طرق مختلفة لعزل sEVs ، واستغلال الكثافة والشكل والحجم والبروتين السطحي ل sEVs11. الطريقتان الأكثر شيوعا في عزلات sEVs هما التقنيات القائمة على الطرد المركزي الفائق والتقنيات القائمة على الترشيح الفائق.
تعتبر الطرق القائمة على الطرد المركزي الفائق طرقا قياسية ذهبية في عزل المركبات الكهربائية. هناك نوعان من تقنيات الطرد المركزي الفائق التي يتم استخدامها عادة وهما الطرد المركزي التفاضلي والطرد المركزي الفائق التدرج الكثاف. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي طرق الطرد المركزي الفائق إلى انخفاض العائد وتتطلب معدات باهظة الثمن لأجهزة الطرد المركزي فائقة السرعة (100000-200000 × جم)11. علاوة على ذلك ، فإن تقنيات الطرد المركزي الفائق وحدها غير فعالة في فصل الأنواع الفرعية للمركبات الكهربائية (sEVs والمركبات الكهربائية الكبيرة) ، مما يؤدي إلى طبقة رواسب غير نقية11. أخيرا ، يمكن أن يستغرق الطرد المركزي الفائق التدرج الكثافي وقتا طويلا ويتطلب خطوات احترازية إضافية مثل إضافة المخزن المؤقت للسكروز لمنع تلف التدرج أثناء خطوات التسارع والتباطؤ12. وبالتالي ، فإن الطرد المركزي الفائق عادة ما يؤدي إلى عائد منخفض نسبيا وغير قادر على التمييز بين مجموعات مختلفة من المركبات الكهربائية13 ، مما يحد من تطبيقه لإعداد المركبات الكهربائية على نطاق واسع11.
الطريقة الثانية لعزل EV هي عن طريق الترشيح الفائق ، والذي يعتمد على ترشيح الحجم. يعتبر الترشيح الفائق فعالا نسبيا من حيث الوقت والتكلفة مقارنة بالطرد المركزي الفائق ، لأنه لا يتضمن معدات باهظة الثمن أو أوقات معالجة طويلة14. وبالتالي ، يبدو أن الترشيح الفائق هو تقنية عزل أكثر فعالية من طريقتي الطرد المركزي الفائق المذكورتين أعلاه. يمكن أن تكون المنتجات المعزولة أكثر تحديدا بناء على أحجام المسام والعائد الأعلى15. ومع ذلك ، قد تؤدي القوة الإضافية المتكبدة أثناء عملية الترشيح إلى تشوه أو ثوران المركبات الكهربائية16.
اقترحت الورقة الحالية بروتوكولا فعالا من حيث التكلفة والوقت لعزل المركبات الكهربائية المشتقة من MSC للتحليل النهائي والأغراض العلاجية. جمعت الطريقة الموصوفة في هذه الورقة بين طريقة ترشيح بسيطة مع الطرد المركزي على مقاعد البدلاء لعزل المركبات الكهربائية عالية الإنتاجية وذات الجودة العالية من hUC-MSCs لتحليل المصب ، بما في ذلك تحليل حجم الجسيمات ، وفحص العلامات الحيوية ، والتصوير المجهري الإلكتروني.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

تعتبر العملية القائمة على الطرد المركزي الفائق الطريقة الشائعة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs). ومع ذلك ، فإن العائد من طريقة العزل هذه أقل نسبيا ، وهذه الطرق غير فعالة في فصل الأنواع الفرعية sEV. توضح هذه الدراسة طريقة ترشيح بسيطة على الطاولة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري (hUC-MSC-sEVs) ، والتي تم فصلها بنجاح عن طريق الترشيح الفائق من الوسط المشروط ل hUC-MSCs. تم تمييز توزيع الحجم وتركيز البروتين والعلامات الخارجية (CD9 و CD81 و TSG101) ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي. كان حجم hUC-MSC-sEVs المعزول 30-200 نانومتر ، مع تركيز جسيم 7.75 × 10 10 جسيمات / مل وتركيز بروتين80 ميكروغرام / مل. لوحظت نطاقات إيجابية للعلامات الخارجية CD9 و CD81 و TSG101. أظهرت هذه الدراسة أن hUC-MSC-sEVs تم عزلها بنجاح من الوسط المكيف hUC-MSCs ، وأظهر التوصيف أن المنتج المعزول استوفى المعايير المذكورة في الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV 2018).

يوضح الشكل 2 أن hUC-MSC-sEVs لها وضع حجم جسيم عند 53 نانومتر ، في حين أن القمم المهمة الأخرى لحجم الجسيمات كانت 96 و 115 نانومتر. كان تركيز hUC-MSC-sEVs المقاسة بواسطة NTA 7.75 × 1010 جسيمات / مل. كان تركيز البروتين في hUC-MSC-sEVs المقاسة باستخدام مقايسة BCA حوالي 80 ميكروغرام / مل.
في...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

يوضح هذا البروتوكول كيفية عزل الحويصلات الجذعية الصغيرة خارج الخلية للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري (hUC-MSC-sEVs) باستخدام إعداد بسيط على نطاق المختبر. يتميز توزيع الحجم وتركيز البروتين وعلامات sEVs ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي.

طريقة ترشيح بسيطة على الطاولة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

هذا بروتوكول بسيط وفعال من حيث الوقت لعزل وتركيز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة. من السهل اعتماد هذه التقنية في معظم المختبرات لأنها مقياس منضدة ولا تتطلب سوى أدوات بسيطة للعمليات. لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية ، نوصي بزراعة الخلايا على نطاق واسع للحصول على ما لا يقل عن مائة مليون خلية.على الرغم من أن الأمر يبدو بسيطا ، إلا أن بعض الخطوات الحاسمة لهذه التقنية يتم إبلاغها بشكل أفضل من خلال العرض المرئي. نأمل أن يتمكن الباحثون من التعلم من تجربتنا وإتقان المهارات بثقة. سيرشدك طالب الدكتوراه لدينا ، السيد تشان ، هونغ هاو ، خلال تجربتنا في عزل وتوصيف الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة.للبدء ، قم بطرد مركزي الوسط المكيف عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. جمع وتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات أكبر من 220 نانومتر. شغل وحدة تصفية الطرد المركزي مع 30 ملليلتر من 0.2 ميكرومتر المالحة المفلترة الفوسفات المخزنة.ثم أجهزة الطرد المركزي وحدة تصفية الطرد المركزي في 3،500g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المحلول في كوب محلول الترشيح. أضف 70 ملليلتر من الوسط المكيف المصفى إلى وحدة تصفية الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي للوحدة عند 3،500 جرام عند أربع درجات مئوية.تخلص من المحلول في كوب محلول الترشيح. أضف 30 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات وجهاز طرد مركزي للوحدة عند 3،500 جرام عند أربع درجات مئوية. قم بتركيب كوب تجميع مركز على وحدة المرشح وأجهزة الطرد المركزي العكسية عند 1،000 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية للحصول على الحويصلات الصغيرة النقية خارج الخلية.قم بتصفية الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. نقل العينات إلى أنابيب جديدة وتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية لمزيد من التحليل. لبدء تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، قم بتخفيف الخلايا الجذعية الوسيطة المعزولة المشتقة من الحبل السري البشري الحويصلات الصغيرة خارج الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات إلى 20 إلى 100 جسيم لكل إطار.أدخل ملليلتر واحد من العينة المخففة في الغرفة المضادة لل A باستخدام محاقن واحدة يمكن التخلص منها. اضبط إعدادات القياس وفقا لذلك. اضبط مستوى الكاميرا على المستوى 14.لكل قياس ، انقر فوق القياس القياسي واضبط التخفيف وفقا لذلك. بعد ذلك ، انقر فوق التقاط ، وابدأ تشغيل الكاميرا ، واضبط مستوى الكاميرا على 14 لتصور المركبات الكهربائية الصغيرة. لبدء القياس، انقر على إنشاء، ثم انقر على تشغيل البرنامج النصي، وحدد الموقع الذي تريد حفظ الملفات فيه.أدخل التفاصيل الضرورية للعينة وانقر فوق موافق. انقر فوق الإعداد موافق لمتابعة البرنامج النصي وانقر فوق موافق لبدء القياس. بمجرد تسجيل القياس ، قم بتحليل النتائج باستخدام عتبة اكتشاف من خمسة لتشمل 10 إلى 100 تقاطع أحمر لكل إطار. ويقتصر عدد التقاطع الأزرق على خمسة.انقر فوق إعداد موافق لمتابعة البرنامج النصي وبدء التحليل. انقر فوق موافق في إشعار البرنامج النصي الكامل والتصدير لتصدير البيانات إلى الموقع المحدد. تحلل الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري البشري الحويصلات الصغيرة خارج الخلية مع مخزن تحلل تحلل المقايسة المناعية الإشعاعية الباردة والاحتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.اجمع المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. حدد كمية البروتين باستخدام مقايسة BCA. قم بتجميع مجموعة الرحلان الكهربائي للهلام وفقا لذلك وقم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام عند 90 فولت حتى يصل البروتين إلى نهاية جل التراص.قم بتغيير الجهد إلى 200 فولت لفصل البروتينات حتى نهاية هلام الحل. قم بإجراء نقل شبه جاف لنقل البروتينات من الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين عند 15 فولت لمدة ساعة واحدة. سد غشاء PVDF مع 3٪ ألبومين مصل البقر في محلول ملحي مخزن بنسبة 0.1٪ توين 20 لمدة ساعة واحدة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.احتضان غشاء PVDF بالأجسام المضادة الأولية عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع اهتزاز مستمر. في اليوم التالي ، اغسل غشاء PVDF خمس مرات وخمس دقائق لكل منهما باستخدام TBST واحتضانه بجسم مضاد ثانوي لمدة ساعة واحدة مع التحريك في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل غشاء PVDF باستخدام TBST خمس مرات وتصور الغشاء في جهاز تصوير مقترن بالشحنة باستخدام كاشف الكشف الكيميائي المضيء.تحليل مستوى التعبير عن البروتينات باستخدام برنامج ImageJ. أولا ، افتح ملف الصورة في ImageJ. قم بتحسين جودة الصورة عن طريق ضبط السطوع والتباين.اضبط الصورة حتى تصبح البقع مرئية بوضوح. انقر فوق الزر "تطبيق" واحفظ الصور بتنسيق TIFF. للتحليل القائم على المجهر الإلكتروني النافذ ، قم بتخفيف جزء واحد من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري البشري ، عينة حويصلات صغيرة خارج الخلية بأربعة أجزاء من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المصفى إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر واحتضانها على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون لمدة 15 دقيقة.قم بإزالة العينة الزائدة باستخدام مناديل معملية واتركها تجف في الهواء لمدة ثلاث دقائق. احتضان 10 ميكرولتر من محلول حمض الفوسفوتونجستيك 1٪ لتلطيخ العينة لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة محلول حمض الفوسفوتونجستيك الزائد بنسبة 1٪ باستخدام مناديل معملية واتركه يجف في الهواء لمدة ثلاث دقائق للتصوير تحت المجهر الإلكتروني النافذ.الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري البشري الحويصلات الصغيرة خارج الخلية لها وضع حجم جسيم يبلغ 53 نانومتر ، في حين أن القمم المهمة الأخرى لحجم الجسيمات كانت 96 و 115 نانومتر. كان تركيز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري التي تم قياسها بواسطة NTA 7.75 في 10 إلى 10 جسيمات لكل ملليلتر. كان تركيز البروتين للحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري والتي تم قياسها باستخدام مقايسة BCA حوالي 80 ميكروغرام لكل ملليلتر.في تحليل النشاف الغربي ، أظهرت الحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري نطاقات إيجابية للعلامات الخارجية CD9 و CD81 و TSG101 ، لكنها كانت سلبية ل GRP94. تم تصور الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الحبل السري البشري المعزول تحت TEM لتحديد حجمها ومورفولوجيتها. الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري البشري حويصلات صغيرة خارج الخلية بحجم 100 نانومتر تقريبا وأظهرت بنية غشاء ثنائية الطبقة تشبه الكأس.مع التطوير الناجح للبروتوكول ، يمكننا الآن الكشف عن الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من حويصلات صغيرة خارج الخلية في الأدوية التجديدية.

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

حجم صغير (1 - 3L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

غرس Ferumoxides إعتبر الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة في عيوب الغضروف

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

طريقه إخراج عاليه لعزل Pericytes الدماغي من الماوس

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...