Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

De publicatie van deze video werd ondersteund door My CytoHealth Sdn. Bhd.

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Menselijke navelstreng mesenchymale stamcellen en cultuur
<ol><li>Kweek de hUC-MSCs met een zaaidichtheid van 5 × 103/cm2 in DMEM, aangevuld met 8% Human Platelet Lysate en 1% Pen-Strep. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO2. Vervang het celkweekmedium om de 3 dagen om een goede celgroe...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

EV's zijn een van de belangrijke subsets van het secretoom in MSC's die een cruciale rol spelen tijdens normale en pathologische processen. Echter, sEV's, met een groottebereik tussen 30 en 200 nm, zijn het afgelopen decennium gestegen als een potentieel hulpmiddel voor celvrije therapie. Er werden verschillende technieken ontwikkeld om sEV's te isoleren van MSC's. Differentiële ultracentrifugatie, ultrafiltratie, precipitatie op basis van polymeren, immunoaffiniteitsafvang en op microfluïdica gebaseerde precipitatie h...

Volgens MISEV 2018 zijn sEV's niet-replicerende lipide dubbellaagse deeltjes zonder functionele kern, met een grootte van 30-200 nm1. MSC-afgeleide sEV's bevatten belangrijke signaalmoleculen die een belangrijke rol spelen bij weefselregeneratie, zoals microRNA, cytokines of eiwitten. Ze zijn in toenemende mate een "hotspot" voor onderzoek geworden in regeneratieve geneeskunde en celvrije therapie. Veel studies hebben aangetoond dat MSC-afgeleide sEV's net zo effectief zijn als MSC's bij de behandeling van verschillende aandoeningen, zoals immunomodulatie 2,3,4,5, het verbeteren van osteogenese 6, diabetes mellitus7,8 of vasculaire regeneratie 9,10. Naarmate de vroege fase van de proeven vordert, zijn drie belangrijke belangrijke kwesties met betrekking tot de klinische vertaling van MSC's-EV's benadrukt: de opbrengst van de EV's, de zuiverheid van de EV's (vrij van celresten en andere biologische verontreinigingen zoals eiwitten en cytokines) en de integriteit van het fosfolipide dubbellaagse membraan van de EV's na isolatie.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om sEV's te isoleren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de dichtheid, vorm, grootte en oppervlakte-eiwit van de sEV's11. De twee meest voorkomende methoden in sEV-isolaties zijn op ultracentrifugatie gebaseerde en op ultrafiltratie gebaseerde technieken.
Op ultracentrifugatie gebaseerde methoden worden beschouwd als gouden standaardmethoden in sEV-isolatie. Twee soorten ultracentrifugatietechnieken die meestal worden gebruikt, zijn differentiële ultracentrifugatie en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Ultracentrifugatiemethoden resulteren echter vaak in een lage opbrengst en vereisen dure apparatuur voor ultracentrifuge met hoge snelheid (100.000-200.000 × g)11. Bovendien zijn ultracentrifugatietechnieken alleen inefficiënt in het scheiden van EV-subtypen (sEV's en grote EV's), wat resulteert in een onzuivere sedimentlaag11. Ten slotte kan ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt ook tijdrovend zijn en aanvullende voorzorgsmaatregelen vereisen, zoals toevoeging van sucrosebuffer om de gradiëntschade tijdens versnellings- en vertragingsstappente remmen 12. Daarom leidt ultracentrifugatie meestal tot een relatief lage opbrengst en is het niet in staat om onderscheid te maken tussen verschillende populaties EV's13, wat de toepassing ervan voor grootschalige EV-preparatenbeperkt 11.
De tweede methode van EV-isolatie is via ultrafiltratie, die is gebaseerd op groottefiltratie. Ultrafiltratie is relatief tijd- en kosteneffectief in vergelijking met ultracentrifugatie, omdat het geen dure apparatuur of lange verwerkingstijden met zich meebrengt14. Ultrafiltratie lijkt dus een effectievere isolatietechniek dan beide bovengenoemde ultracentrifugatiemethoden. De geïsoleerde producten kunnen specifieker zijn op basis van poriegroottes en hogere opbrengst15. De extra kracht die tijdens het filtratieproces wordt opgelopen, kan echter leiden tot de vervorming of uitbarsting van de EV's16.
De huidige paper stelde een kosten- en tijdseffectief benchtop-protocol voor het isoleren van MSC-afgeleide sEV's voor downstream-analyse en therapeutische doeleinden. De methode die in dit artikel wordt beschreven, combineerde een eenvoudige filtratiemethode met bench-top centrifugatie om hoogrenderende en kwalitatief goede EV's te isoleren van hUC-MSCs voor downstream-analyse, inclusief deeltjesgrootteanalyse, biomarkertest en elektronenmicroscopische beeldvorming.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

Het op ultracentrifugatie gebaseerde proces wordt beschouwd als de gebruikelijke methode voor isolatie van kleine extracellulaire blaasjes (sEV's). De opbrengst van deze isolatiemethode is echter relatief lager en deze methoden zijn inefficiënt in het scheiden van sEV-subtypen. Deze studie demonstreert een eenvoudige benchtopfiltratiemethode om van menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) te isoleren, met succes gescheiden door ultrafiltratie van het geconditioneerde medium van hUC-MSCs. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, exosomale markers (CD9, CD81, TSG101) en morfologie van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV's werden gekarakteriseerd met respectievelijk nanodeeltjestraceringsanalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop. De grootte van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV's was 30-200 nm, met een deeltjesconcentratie van 7,75 × 10 10 deeltjes / ml en een eiwitconcentratie van80 μg / ml. Positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101 werden waargenomen. Deze studie toonde aan dat hUC-MSC-sEV's met succes werden geïsoleerd uit hUC-MSCs geconditioneerd medium, en karakterisering toonde aan dat het geïsoleerde product voldeed aan de criteria vermeld in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Figuur 2 laat zien dat hUC-MSC-sEV's een deeltjesgroottemodus hebben bij 53 nm, terwijl andere significante pieken van deeltjesgrootte 96 en 115 nm waren. De concentratie hUC-MSC-sEV's gemeten door NTA was 7,75 × 1010 deeltjes / ml. De eiwitconcentratie van hUC-MSC-sEV's gemeten met de BCA-test was ongeveer 80 μg/ml.
In western blotting-analyse toonden hUC-MSC-sEV's positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101, maar waren negatief voor ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Dit is een eenvoudig en tijdeffectief protocol om kleine extracellulaire blaasjes uit mesenchymale stamcellen te isoleren en te concentreren. Deze techniek is gemakkelijk toe te passen in de meeste laboratoria, omdat het een tafelschaal is en alleen eenvoudige instrumenten voor operaties vereist. Om een van de kleine extracellulaire blaasjes te isoleren, raden we aan om cellen op grote schaal te kweken om minimaal honderd miljoen cellen te verkrijgen.Hoewel het eenvoudig klinkt, zijn bepaalde kritische stappen van deze techniek beter geïnformeerd door visuele demonstratie. We hopen dat onderzoekers van onze ervaring kunnen leren en de vaardigheden vol vertrouwen onder de knie kunnen krijgen. Onze promovendus, Mr.Chan, Hong Hao, zal u begeleiden door onze ervaring in isolatie en karakteriseringen van kleine extracellulaire blaasjes uit mesenchymale stamcellen.Om te beginnen, centrifugeer het geconditioneerde medium op 200g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om celresten te verwijderen. Verzamel en filter het supernatant door een filter van 0,22 micrometer om deeltjes groter dan 220 nanometer te verwijderen. Vulde een centrifugaalfiltereenheid met 30 milliliter 0,2 micrometer gefilterde fosfaat-gebufferde zoutoplossing.Centrifugeer vervolgens de centrifugaalfiltereenheid op 3.500 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi de oplossing weg in de beker met filtraatoplossing. Voeg 70 milliliter gefilterd geconditioneerd medium toe aan de centrifugaalfiltereenheid en centrifugeer de eenheid op 3.500 g bij vier graden Celsius.Gooi de oplossing weg in de beker met filtraatoplossing. Voeg 30 milliliter gefilterde fosfaat-gebufferde zoutoplossing toe en centrifugeer het apparaat op 3.500 g bij vier graden Celsius. Installeer een concentraatopvangbeker op de filtereenheid en draai de centrifuge gedurende twee minuten bij 1.000 g bij vier graden Celsius om de gezuiverde kleine extracellulaire blaasjes te verkrijgen.Filter de kleine extracellulaire blaasjes door een spuitfilter van 0,22 micrometer. Breng de monsters over naar nieuwe buizen en bewaar ze bij 80 graden Celsius voor verdere analyse. Om te beginnen met de analyse van het volgen van nanodeeltjes, verdunt u de geïsoleerde menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kleine extracellulaire blaasjes in gefilterde fosfaat-gebufferde zoutoplossing tot 20 tot 100 deeltjes per frame.Breng één milliliter van het verdunde monster in de anti-A-kamer met behulp van één milliliter wegwerpspuiten. Stel de meetinstellingen dienovereenkomstig in. Stel het cameraniveau in op niveau 14.Klik voor elke meting op de standaardmeting en stel de verdunning dienovereenkomstig in. Klik vervolgens op Vastleggen, Camera starten en stel het cameraniveau in op 14 om de kleine EV's te visualiseren. Als u de meting wilt starten, klikt u op Maken, vervolgens op Script uitvoeren en selecteert u de locatie waar de bestanden moeten worden opgeslagen.Toets de benodigde gegevens van het voorbeeld in en klik op OK. Klik op de instelling OK om door te gaan met het script en klik op OK om de meting te starten. Zodra de meting is geregistreerd, analyseert u de resultaten met een detectiedrempel van vijf om 10 tot 100 rode kruizen per frame op te nemen. En het aantal blauwe kruisen is beperkt tot vijf.Klik op OK instellen om door te gaan met het script en de analyse te starten. Klik op OK in de melding script voltooien en exporteren om de gegevens naar de ingestelde locatie te exporteren. Lyseer de menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen, kleine extracellulaire blaasjes met ijskoude radioimmunoprecipitatie assay lysisbuffer en incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Verzamel het supernatant na centrifugeren op 200g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Kwantificeer het eiwit met behulp van een BCA-test. Stel de gelelektroforese dienovereenkomstig samen en voer gelelektroforese uit op 90 volt totdat het eiwit het uiteinde van de stapelgel bereikt.Verander de spanning naar 200 volt om de eiwitten te scheiden tot het einde van de oplossende gel. Voer semi-droge overdracht uit om de eiwitten van de gel over te brengen naar een polyvinylideendifluoridemembraan bij 15 volt gedurende één uur. Blokkeer het PVDF-membraan met 3% runderserumalbumine in tris-gebufferde zoutoplossing 0,1% Tween 20 gedurende één uur op een shaker bij kamertemperatuur.Incubeer het PVDF-membraan met primaire antilichamen bij vier graden Celsius gedurende de nacht met constant schudden. Was de volgende dag het PVDF-membraan vijf keer en vijf minuten elk met TBST en incubeer verder met een secundair antilichaam gedurende een uur met roeren bij kamertemperatuur. Nogmaals, was het PVDF-membraan vijf keer met TBST en visualiseer het membraan in een charge-coupled imager met behulp van een chemiluminescent detectiereagens.Analyseer het expressieniveau van de eiwitten met behulp van ImageJ-software. Open eerst het afbeeldingsbestand in ImageJ. Verbeter de kwaliteit van de afbeelding door de helderheid en het contrast aan te passen.Pas de afbeelding aan totdat de vlekken duidelijk zichtbaar zijn. Klik op de knop Toepassen en sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling. Voor analyse op basis van transmissie-elektronenmicroscopen, verdunt u een deel van het van de menselijke navelstreng afgeleide mesenchymale stamcellenmonster met vier delen gefilterde fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een totaal volume van 10 microliter en incubeer u gedurende 15 minuten op een met koolstof gecoat koperrooster.Verwijder het overtollige monster met een laboratoriumdoekje en laat het drie minuten aan de lucht drogen. Incubeer 10 microliter 1% fosfotungstische zuuroplossing om het monster gedurende drie minuten te kleuren. Verwijder de overtollige 1% fosfotungstic acid-oplossing met behulp van een laboratoriumdoekje en laat het drie minuten aan de lucht drogen om onder een transmissie-elektronenmicroscoop in beeld te brengen.Menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kleine extracellulaire blaasjes hebben een deeltjesgroottemodus van 53 nanometer, terwijl andere significante pieken van deeltjesgrootte 96 en 115 nanometer waren. De concentratie van van menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes gemeten door NTA was 7,75 maal 10 tot de 10e deeltjes per milliliter. De eiwitconcentratie van van de menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes gemeten met de BCA-test was ongeveer 80 microgram per milliliter.In western blotting-analyse vertoonden van de menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101, maar waren negatief voor GRP94. De geïsoleerde menselijke navelstreng-afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes werden gevisualiseerd onder TEM om hun grootte en morfologie te bepalen. Menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen, kleine extracellulaire blaasjes ter grootte van ongeveer 100 nanometer en vertoonden een cup-achtige dubbellaagse membraanstructuur.Met de succesvolle ontwikkeling van het protocol kunnen we nu de therapeutische mogelijkheden van mesenchymale stamcellen afgeleide kleine extracellulaire blaasjes in regeneratieve geneesmiddelen ontdekken.

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

Klein volume (1-3L) Filtratie van Coastal Zeewater Monsters

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Implantatie van Ferumoxides Gelabelde humane mesenchymale stamcellen in kraakbeenletsels

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

Een hoge Uitvoermethode om cerebrale Pericytes van de muis te isoleren

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...