Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

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REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain et culture
<ol><li>Culture des hUC-MSCs à une densité d’ensemencement de 5 × 103/cm2 dans du DMEM, complétée par 8% de lysat plaquettaire humain et 1% de Pen-Strep. Incuber les cellules à 37 °C dans 5% de CO2</su...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

Les VE sont l’un des sous-ensembles importants du sécrétome dans les CSM qui jouent un rôle crucial au cours des processus normaux et pathologiques. Cependant, les sEV, dont la taille varie entre 30 et 200 nm, sont devenues un outil potentiel pour la thérapie acellulaire au cours de la dernière décennie. Diverses techniques ont été développées pour isoler les sEV des CSM. Cependant, l’ultracentrifugation différentielle, l’ultrafiltration, la précipitation à base de polymères, la capture d’immunoaffi...

Selon MISEV 2018, les sEV sont des particules bicouches lipidiques non réplicatives sans noyau fonctionnel présent, d’une taille de 30-200 nm1. Les sEV dérivés de la CSM contiennent d’importantes molécules de signalisation qui jouent un rôle important dans la régénération des tissus, telles que les microARN, les cytokines ou les protéines. Ils sont devenus de plus en plus un « point chaud » de la recherche en médecine régénérative et en thérapie acellulaire. De nombreuses études ont montré que les sEV dérivés des CSM sont aussi efficaces que les CSM dans le traitement de différentes affections, telles que l’immunomodulation 2,3,4,5, l’amélioration de l’ostéogenèse 6, le diabète sucré 7,8 ou la régénération vasculaire 9,10. Au fur et à mesure que les essais de phase préliminaire progressent, trois questions clés principales liées à la traduction clinique des CSM-VE ont été mises en évidence : le rendement des VE, la pureté des VE (exemptes de débris cellulaires et d’autres contaminants biologiques tels que les protéines et les cytokines) et l’intégrité de la membrane bicouche phospholipide des VE après isolement.
Diverses méthodes ont été développées pour isoler les sEV, en exploitant la densité, la forme, la taille et la protéine de surface des sEV11. Les deux méthodes les plus courantes dans les isolements de sEV sont les techniques basées sur l’ultracentrifugation et l’ultrafiltration.
Les méthodes basées sur l’ultracentrifugation sont considérées comme des méthodes de référence dans l’isolation des sEV. Deux types de techniques d’ultracentrifugation qui sont généralement utilisées sont l’ultracentrifugation différentielle et l’ultracentrifugation par gradient de densité. Cependant, les méthodes d’ultracentrifugation entraînent souvent un faible rendement et nécessitent un équipement coûteux pour l’ultracentrifugeuse à grande vitesse (100 000-200 000 × g)11. De plus, les techniques d’ultracentrifugation seules sont inefficaces pour séparer les sous-types de VE (sEV et gros EV), ce qui donne une couche de sédiments impurs11. Enfin, l’ultracentrifugation du gradient de densité pourrait également prendre beaucoup de temps et nécessiter des mesures de précaution supplémentaires telles que l’ajout d’un tampon saccharose pour inhiber les dommages du gradient pendant les étapes d’accélération et de décélération12. Par conséquent, l’ultracentrifugation conduit généralement à un rendement relativement faible et n’est pas capable de faire la distinction entre les différentes populations de VE13, ce qui limite son application pour la préparation à grande échelledes VE 11.
La deuxième méthode d’isolation des véhicules électriques est l’ultrafiltration, qui est basée sur la filtration de taille. L’ultrafiltration est relativement rapide et économique par rapport à l’ultracentrifugation, car elle n’implique pas d’équipement coûteux ou de longs temps de traitement14. Par conséquent, l’ultrafiltration semble être une technique d’isolement plus efficace que les deux méthodes d’ultracentrifugation susmentionnées. Les produits isolés peuvent être plus spécifiques en fonction de la taille des pores et du rendement plus élevé15. Cependant, la force supplémentaire encourue pendant le processus de filtration peut entraîner la déformation ou l’éruption des VE16.
Le présent document proposait un protocole de paillasse rentable et rapide pour isoler les EVs dérivés des CSM à des fins d’analyse en aval et à des fins thérapeutiques. La méthode décrite dans cet article combinait une méthode de filtration simple avec une centrifugation sur paillasse pour isoler les véhicules électriques à haut rendement et de bonne qualité des CSM-hUC pour l’analyse en aval, y compris l’analyse granulométrique, le test de biomarqueurs et l’imagerie au microscope électronique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

Le procédé basé sur l’ultracentrifugation est considéré comme la méthode courante pour l’isolement des petites vésicules extracellulaires (EV). Cependant, le rendement de cette méthode d’isolement est relativement plus faible, et ces méthodes sont inefficaces pour séparer les sous-types de sEV. Cette étude démontre une méthode de filtration de paillasse simple pour isoler les petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain (hUC-MSC-sEV), séparées avec succès par ultrafiltration du milieu conditionné des hUC-MSC. La distribution granulométrique, la concentration en protéines, les marqueurs exosomaux (CD9, CD81, TSG101) et la morphologie des hUC-MSC-sEV isolés ont été caractérisés par analyse de suivi des nanoparticules, dosage de la protéine BCA, transfert Western et microscope électronique à transmission, respectivement. La taille des hUC-MSC-sEVs isolés était de 30 à 200 nm, avec une concentration de particules de 7,75 × 1010 particules/mL et une concentration de protéines de 80 μg/mL. Des bandes positives pour les marqueurs exosomiques CD9, CD81 et TSG101 ont été observées. Cette étude a montré que les hUC-MSC-sEVs ont été isolés avec succès à partir d’un milieu conditionné par des hUC-MSC, et la caractérisation a montré que le produit isolé répondait aux critères mentionnés par Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

La figure 2 montre que les hUC-MSC-sEV ont un mode granulométrique à 53 nm, tandis que les autres pics significatifs de taille des particules étaient de 96 et 115 nm. La concentration de hUC-MSC-sEVs mesurée par NTA était de 7,75 × 1010 particules/mL. La concentration protéique des hUC-MSC-sEVs mesurée avec le test BCA était d’environ 80 μg/mL.
Dans l’analyse par transfert Western, les hUC-MSC-sEV ont montré des bandes positives pour les ...

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A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Ce protocole montre comment isoler les petites vésicules extracellulaires des cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain (hUC-MSC-sEVs) avec un simple réglage de paillasse à l’échelle du laboratoire. La distribution granulométrique, la concentration en protéines, les marqueurs de sEVs et la morphologie des hUC-MSC-sEVs isolés sont caractérisés par l’analyse de suivi des nanoparticules, le dosage de la protéine BCA, le transfert Western et le microscope électronique à transmission, respectivement.

Une méthode de filtration de paillasse simple pour isoler de petites vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Il s’agit d’un protocole simple et efficace pour isoler et concentrer de petites vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses. Cette technique est facile à adopter dans la plupart des laboratoires car il s’agit d’une échelle de paillasse et ne nécessite que des instruments simples pour les opérations. Pour isoler une des petites vésicules extracellulaires, nous recommandons de cultiver des cellules à grande échelle pour obtenir un minimum de cent millions de cellules.Bien que cela semble simple, certaines étapes critiques de cette technique sont mieux informées par une démonstration visuelle. Nous espérons que les chercheurs pourront apprendre de notre expérience et maîtriser les compétences en toute confiance. Notre doctorant, M. Chan, Hong Hao, vous guidera à travers notre expérience dans l’isolement et la caractérisation de petites vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses.Pour commencer, centrifuger le milieu conditionné à 200g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Recueillir et filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 micromètre pour éliminer les particules de plus de 220 nanomètres. Rempli une unité de filtration centrifuge avec 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate filtrée de 0,2 micromètre.Ensuite, centrifuger l’unité de filtration centrifuge à 3, 500g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter la solution dans le gobelet de solution de filtrat. Ajouter 70 millilitres de milieu conditionné filtré dans l’unité de filtration centrifuge et centrifuger l’unité à 3, 500g à quatre degrés Celsius.Jeter la solution dans le gobelet de solution de filtrat. Ajouter 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate filtrée et centrifuger l’unité à 3 500 g à quatre degrés Celsius. Installez une coupelle de collecte de concentré sur l’unité de filtration et inversez la centrifugeuse à 1 000 g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir les petites vésicules extracellulaires purifiées.Filtrer les petites vésicules extracellulaires à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre. Transférer les échantillons dans de nouveaux tubes et les stocker à 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie. Pour commencer l’analyse de suivi des nanoparticules, diluez les cellules souches mésenchymateuses isolées du cordon ombilical humain de petites vésicules extracellulaires dans une solution saline filtrée tamponnée au phosphate à 20 à 100 particules par image.Introduire un millilitre de l’échantillon dilué dans la chambre anti-A à l’aide de seringues jetables d’un millilitre. Réglez les paramètres de mesure en conséquence. Réglez le niveau de la caméra au niveau 14.Pour chaque mesure, cliquez sur la mesure standard et réglez la dilution en conséquence. Ensuite, cliquez sur Capturer, démarrer la caméra et réglez le niveau de la caméra sur 14 pour visualiser les petits véhicules électriques. Pour lancer la mesure, cliquez sur Créer, puis sur Exécuter le script et sélectionnez l’emplacement où les fichiers doivent être enregistrés.Saisissez les détails nécessaires de l’exemple et cliquez sur OK. Cliquez sur le paramètre OK pour continuer le script et cliquez sur OK pour lancer la mesure. Une fois la mesure enregistrée, analysez les résultats avec un seuil de détection de cinq pour inclure 10 à 100 croix rouges par image. Et le nombre de croix bleues est limité à cinq.Cliquez sur Paramètre OK pour continuer le script et lancer l’analyse. Cliquez sur OK dans la notification de script terminé et exportez pour exporter les données vers l’emplacement défini. Lyser les cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain petites vésicules extracellulaires avec un tampon de lyse de dosage de radioimmunoprécipitation glacial et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Recueillir le surnageant après centrifugation à 200g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Quantifier la protéine à l’aide d’un test BCA. Assemblez le jeu d’électrophorèse sur gel en conséquence et effectuez l’électrophorèse sur gel à 90 volts jusqu’à ce que la protéine atteigne l’extrémité du gel d’empilage.Changez la tension à 200 volts pour séparer les protéines jusqu’à la fin du gel de résolution. Effectuer un transfert semi-sec pour transférer les protéines du gel à une membrane de difluorure de polyvinylidène à 15 volts pendant une heure. Bloquer la membrane PVDF avec 3% d’albumine sérique bovine dans une solution saline tamponnée au tris 0,1% Tween 20 pendant une heure sur un agitateur à température ambiante.Incuber la membrane PVDF avec des anticorps primaires à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec des secousses constantes. Le lendemain, laver la membrane PVDF cinq fois et cinq minutes chacune avec TBST et incuber avec un anticorps secondaire pendant une heure en agitant à température ambiante. Encore une fois, lavez la membrane PVDF avec TBST cinq fois et visualisez la membrane dans un imageur à couplage de charge à l’aide d’un réactif de détection chimiluminescent.Analysez le niveau d’expression des protéines à l’aide du logiciel ImageJ. Tout d’abord, ouvrez le fichier image dans ImageJ. Améliorez la qualité de l’image en ajustant la luminosité et le contraste.Ajustez l’image jusqu’à ce que les taches soient clairement visibles. Cliquez sur le bouton Appliquer et enregistrez les images au format TIFF. Pour l’analyse au microscope électronique à transmission, diluer une partie du petit échantillon de vésicules extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain avec quatre parties de solution saline filtrée tamponnée au phosphate jusqu’à obtenir un volume total de 10 microlitres et incuber sur une grille de cuivre recouverte de carbone pendant 15 minutes.Retirez l’échantillon excédentaire à l’aide d’une lingette de laboratoire et laissez-le sécher à l’air libre pendant trois minutes. Incuber 10 microlitres de solution d’acide phosphotungstique à 1% pour colorer l’échantillon pendant trois minutes. Retirez l’excès de solution d’acide phosphotungstique à 1 % à l’aide d’une lingette de laboratoire et laissez-la sécher à l’air libre pendant trois minutes pour obtenir une image au microscope électronique à transmission.Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain Les petites vésicules extracellulaires ont un mode de taille de particules de 53 nanomètres, tandis que d’autres pics significatifs de taille de particules étaient de 96 et 115 nanomètres. La concentration de petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain mesurée par NTA était de 7,75 fois 10 à la 10ème particules par millilitre. La concentration en protéines des petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain mesurée avec le test BCA était d’environ 80 microgrammes par millilitre.Dans l’analyse par transfert Western, les petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain ont montré des bandes positives pour les marqueurs exosomaux CD9, CD81 et TSG101, mais étaient négatives pour GRP94. Les petites vésicules extracellulaires MSC isolées dérivées du cordon ombilical humain ont été visualisées sous TEM pour déterminer leur taille et leur morphologie. Cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain petites vésicules extracellulaires d’environ 100 nanomètres et montrant une structure membranaire bicouche en forme de coupe.Avec le développement réussi du protocole, nous pouvons maintenant découvrir le potentiel thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses dérivées de petites vésicules extracellulaires dans les médicaments régénératifs.

Research

JoVE Journal

Biology

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Recherche

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Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

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The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

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Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

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