Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

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HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Mesenchymale Stammzellen und Kultur der menschlichen Nabelschnur
<ol><li>Kultivieren Sie die hUC-MSCs bei einer Aussaatdichte von 5 × 103/cm2 in DMEM, ergänzt mit 8 % humanem Thrombozytenlysat und 1 % Pen-Streptokokken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO2. Tauschen Sie das Z...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

EVs sind eine der wichtigen Untergruppen des Sekretoms in MSCs, die eine entscheidende Rolle bei normalen und pathologischen Prozessen spielen. Allerdings haben sEVs mit einem Größenbereich zwischen 30 und 200 nm in den letzten zehn Jahren als potenzielles Werkzeug für die zellfreie Therapie zugenommen. Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um sEVs aus MSCs zu isolieren. Differentielle Ultrazentrifugation, Ultrafiltration, polymerbasierte Fällung, Immunaffinitätserfassung und mikrofluidikbasierte Fällung wei...

Laut MISEV 2018 handelt es sich bei sEVs um nicht-replizierende Lipiddoppelschichtpartikel ohne funktionellen Zellkern mit einer Größe von 30-200nm1. MSC-abgeleitete sEVs enthalten wichtige Signalmoleküle, die eine wichtige Rolle bei der Geweberegeneration spielen, wie z. B. microRNA, Zytokine oder Proteine. Sie haben sich zunehmend zu einem Forschungs-"Hotspot" in der regenerativen Medizin und der zellfreien Therapie entwickelt. Viele Studien haben gezeigt, dass MSC-abgeleitete sEVs bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen genauso wirksam sind wie MSCs, wie z. B. Immunmodulation 2,3,4,5, Verbesserung der Osteogenese 6, Diabetes mellitus7,8 oder vaskuläre Regeneration 9,10. Im Laufe der frühen Phase der Studien wurden drei Hauptprobleme in Bezug auf die klinische Translation von MSCs-EVs hervorgehoben: die Ausbeute der EVs, die Reinheit der EVs (frei von Zelltrümmern und anderen biologischen Verunreinigungen wie Proteinen und Zytokinen) und die Integrität der Phospholipid-Doppelschichtmembran der EVs nach der Isolierung.
Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um sEVs zu isolieren, wobei die Dichte, Form, Größe und das Oberflächenprotein der sEVs ausgenutzt werden11. Die beiden gebräuchlichsten Methoden bei der Isolierung von sEVs sind ultrazentrifugationsbasierte und ultrafiltrationsbasierte Techniken.
Ultrazentrifugationsbasierte Methoden gelten als Goldstandardmethoden bei der Isolierung von sEVs. Zwei Arten von Ultrazentrifugationstechniken, die normalerweise verwendet werden, sind die differentielle Ultrazentrifugation und die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Ultrazentrifugationsmethoden führen jedoch oft zu einer geringen Ausbeute und erfordern teure Geräte für Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugen (100.000-200.000 × g)11. Darüber hinaus sind Ultrazentrifugationstechniken allein ineffizient bei der Trennung von EV-Subtypen (sEVs und große EVs), was zu einer unreinen Sedimentschichtführt 11. Schließlich könnte die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation auch zeitaufwändig sein und zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen erfordern, wie z. B. die Zugabe von Saccharosepuffer, um die Gradientenschädigung während der Beschleunigungs- und Verzögerungsschritte12 zu verhindern. Daher führt die Ultrazentrifugation in der Regel zu einer relativ geringen Ausbeute und ist nicht in der Lage, zwischen verschiedenen Populationen von EVs13 zu unterscheiden, was ihre Anwendung für die großtechnische EV-Präparation11 einschränkt.
Die zweite Methode der EV-Isolierung ist die Ultrafiltration, die auf der Größenfiltration basiert. Die Ultrafiltration ist im Vergleich zur Ultrazentrifugation relativ zeit- und kosteneffizient, da sie keine teuren Geräte oder langen Verarbeitungszeiten erfordert14. Daher scheint die Ultrafiltration eine effektivere Isolationstechnik zu sein als die beiden oben genannten Ultrazentrifugationsmethoden. Die isolierten Produkte können je nach Porengröße und höherer Ausbeute spezifischer sein15. Die zusätzliche Kraft, die während des Filtrationsprozesses entsteht, kann jedoch zur Verformung oder zum Ausbruch der EVs16 führen.
In der vorliegenden Arbeit wird ein kosten- und zeiteffizientes Benchtop-Protokoll zur Isolierung von MSC-abgeleiteten sEVs für nachgelagerte Analysen und therapeutische Zwecke vorgeschlagen. Die in diesem Artikel beschriebene Methode kombinierte eine einfache Filtrationsmethode mit einer Tischzentrifugation, um ertragreiche und qualitativ hochwertige EVs aus hUC-MSCs für die nachgelagerte Analyse zu isolieren, einschließlich Partikelgrößenanalyse, Biomarker-Assay und elektronenmikroskopischer Bildgebung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

Das auf Ultrazentrifugation basierende Verfahren gilt als die gängigste Methode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs). Die Ausbeute dieser Isolationsmethode ist jedoch relativ gering, und diese Methoden sind ineffizient bei der Trennung von sEV-Subtypen. Diese Studie demonstriert eine einfache Benchtop-Filtrationsmethode zur Isolierung von aus humanen Nabelschnur gewonnenen kleinen extrazellulären MSC-Vesikeln (hUC-MSC-sEVs), die erfolgreich durch Ultrafiltration aus dem konditionierten Medium von hUC-MSCs getrennt wurden. Die Größenverteilung, die Proteinkonzentration, die exosomalen Marker (CD9, CD81, TSG101) und die Morphologie der isolierten hUC-MSC-sEVs wurden mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert. Die Größe der isolierten hUC-MSC-sEVs betrug 30-200 nm, mit einer Partikelkonzentration von 7,75 × 10 10 Partikeln/ml und einer Proteinkonzentration von80 μg/ml. Es wurden positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101 beobachtet. Diese Studie zeigte, dass hUC-MSC-sEVs erfolgreich aus hUC-MSCs konditioniertem Medium isoliert wurden, und die Charakterisierung zeigte, dass das isolierte Produkt die in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018) genannten Kriterien erfüllte.

Abbildung 2 zeigt, dass hUC-MSC-sEVs einen Partikelgrößenmodus bei 53 nm aufweisen, während andere signifikante Peaks der Partikelgröße bei 96 und 115 nm lagen. Die mit NTA gemessene Konzentration von hUC-MSC-sEVs betrug 7,75 × 1010 Partikel/ml. Die mit dem BCA-Assay gemessene Proteinkonzentration der hUC-MSC-sEVs betrug ca. 80 μg/ml.
In der Western-Blotting-Analyse zeigten hUC-MSC-sEVs positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG...

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A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.

Eine einfache Tischfiltrationsmethode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Dies ist ein einfaches und zeitsparendes Protokoll zur Isolierung und Konzentration kleiner extrazellulärer Vesikel aus mesenchymalen Stammzellen. Diese Technik ist in den meisten Laboren leicht anzuwenden, da es sich um einen Tischmaßstab handelt, für den nur einfache Instrumente erforderlich sind. Um kleine extrazelluläre Vesikel zu isolieren, empfehlen wir, Zellen in großem Maßstab zu züchten, um mindestens hundert Millionen Zellen zu erhalten.Obwohl es einfach klingt, werden bestimmte kritische Schritte dieser Technik besser durch visuelle Demonstrationen informiert. Wir hoffen, dass die Forschenden aus unseren Erfahrungen lernen und die Fähigkeiten sicher beherrschen können. Unser Doktorand, Herr Chan, Hong Hao, wird Sie durch unsere Erfahrungen in der Isolierung und Charakterisierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus mesenchymalen Stammzellen führen.Zentrifugieren Sie zunächst das konditionierte Medium bei 200 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellreste zu entfernen. Sammeln und filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um Partikel zu entfernen, die größer als 220 Nanometer sind. Befüllung einer Zentrifugalfilteranlage mit 30 Millilitern 0,2 Mikrometer filtrierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Anschließend zentrifugieren Sie die Zentrifugalfiltereinheit bei 3.500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Geben Sie 70 Milliliter filtriertes konditioniertes Medium in die Zentrifugalfiltereinheit und zentrifugieren Sie das Gerät bei 3.500 g bei vier Grad Celsius.Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Fügen Sie 30 Milliliter filtrierte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu und zentrifugieren Sie das Gerät bei 3.500 g bei vier Grad Celsius. Setzen Sie einen Konzentratauffangbecher auf die Filtereinheit und zentrifugieren Sie bei 1.000 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius, um die gereinigten kleinen extrazellulären Vesikel zu erhalten.Filtern Sie die kleinen extrazellulären Vesikel durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter. Übertragen Sie die Proben in neue Röhrchen und lagern Sie sie zur weiteren Analyse bei 80 Grad Celsius. Um mit der Nanopartikel-Tracking-Analyse zu beginnen, verdünnen Sie die isolierten mesenchymalen Stammzellen der humanen Nabelschnur, kleine extrazelluläre Vesikel in gefilterter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, auf 20 bis 100 Partikel pro Bild.Geben Sie einen Milliliter der verdünnten Probe mit Einwegspritzen von einem Milliliter in die Anti-A-Kammer. Stellen Sie die Messeinstellungen entsprechend ein. Stellen Sie die Kamerastufe auf Stufe 14 ein.Klicken Sie für jede Messung auf das Standardmaß und stellen Sie die Verdünnung entsprechend ein. Klicken Sie anschließend auf Aufnehmen, Kamera starten und stellen Sie die Kamerastufe auf 14 ein, um die kleinen Elektrofahrzeuge zu visualisieren. Um die Messung zu starten, klicken Sie auf Erstellen, dann auf Skript ausführen und wählen Sie den Speicherort aus, an dem die Dateien gespeichert werden sollen.Geben Sie die erforderlichen Details des Beispiels ein und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die Einstellung OK, um das Skript fortzusetzen, und klicken Sie auf OK, um die Messung zu starten. Sobald die Messung aufgezeichnet wurde, analysieren Sie die Ergebnisse mit einer Erkennungsschwelle von fünf, um 10 bis 100 rote Kreuze pro Bild einzubeziehen. Und die Anzahl der blauen Kreuze ist auf fünf begrenzt.Klicken Sie auf Einstellung OK, um das Skript fortzusetzen und die Analyse zu starten. Klicken Sie auf OK, wenn das Skript die Benachrichtigung über den Abschluss und den Export enthält, um die Daten an den festgelegten Speicherort zu exportieren. Die aus der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen, kleine extrazelluläre Vesikel, werden mit eiskaltem Radioimmunpräzipitations-Assay-Lysepuffer lysiert und 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.Sammeln Sie den Überstand nach dem Zentrifugieren bei 200 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Quantifizieren Sie das Protein mit einem BCA-Assay. Stellen Sie das Gelelektrophorese-Set entsprechend zusammen und führen Sie die Gelelektrophorese bei 90 Volt durch, bis das Protein das Ende des Stapelgels erreicht.Ändern Sie die Spannung auf 200 Volt, um die Proteine bis zum Ende des auflösenden Gels zu trennen. Führen Sie einen halbtrockenen Transfer durch, um die Proteine eine Stunde lang bei 15 Volt aus dem Gel auf eine Polyvinylidendifluoridmembran zu übertragen. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 3 % Kälberserumalbumin in trisgepufferter Kochsalzlösung 0,1 % Tween 20 für eine Stunde auf einem Schüttler bei Raumtemperatur.Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit Primärantikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht unter ständigem Schütteln. Am nächsten Tag wird die PVDF-Membran fünfmal und jeweils fünf Minuten mit TBST gewaschen und mit einem Sekundärantikörper eine Stunde lang unter Rühren bei Raumtemperatur weiter inkubiert. Waschen Sie die PVDF-Membran erneut fünfmal mit TBST und visualisieren Sie die Membran in einem ladungsgekoppelten Imager mit einem Chemilumineszenz-Detektionsreagenz.Analysieren Sie das Expressionsniveau der Proteine mit der ImageJ-Software. Öffnen Sie zunächst die Bilddatei in ImageJ. Verbessern Sie die Bildqualität, indem Sie Helligkeit und Kontrast anpassen.Passen Sie das Bild an, bis die Flecken deutlich sichtbar sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format. Für die transmissionselektronenmikroskopische Analyse wird ein Teil der aus der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellenprobe mit vier Teilen filtrierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf ein Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern verdünnt und 15 Minuten lang auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter inkubiert.Entfernen Sie die überschüssige Probe mit einem Labortuch und lassen Sie sie drei Minuten lang an der Luft trocknen. Inkubieren Sie 10 Mikroliter 1%ige Phosphowolframsäurelösung, um die Probe drei Minuten lang zu färben. Entfernen Sie die überschüssige 1%ige Phosphowolframsäurelösung mit einem Labortuch und lassen Sie sie drei Minuten lang an der Luft trocknen, um sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop abzubilden.Die kleinen extrazellulären Vesikel der menschlichen Nabelschnur aus mesenchymalen Stammzellen haben eine Partikelgröße von 53 Nanometern, während andere signifikante Peaks der Partikelgröße 96 und 115 Nanometer betrugen. Die mit NTA gemessene Konzentration von kleinen extrazellulären MSC-Vesikeln aus menschlicher Nabelschnur betrug 7,75 mal 10 bis 10 Partikel pro Milliliter. Die mit dem BCA-Assay gemessene Proteinkonzentration der kleinen extrazellulären MSC-Vesikel aus menschlicher Nabelschnur betrug etwa 80 Mikrogramm pro Milliliter.In der Western-Blotting-Analyse zeigten die kleinen extrazellulären MSC-Vesikel der menschlichen Nabelschnur positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101, waren aber negativ für GRP94. Die isolierten humanen MSC-kleinzellulären MSC-Vesikel wurden unter TEM visualisiert, um ihre Größe und Morphologie zu bestimmen. Humane mesenchymale Stammzellen aus der Nabelschnur waren kleine extrazelluläre Vesikel mit einer Größe von etwa 100 Nanometern und zeigten eine becherartige Doppelschicht-Membranstruktur.Mit der erfolgreichen Entwicklung des Protokolls können wir nun das therapeutische Potenzial von mesenchymalen Stammzellen aus kleinen extrazellulären Vesikeln in der regenerativen Medizin aufdecken.

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume (1-3L) Filtration von Coastal Meerwasser Proben

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Forschung

Biologie

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Die Implantation von Ferumoxides Labeled humanen mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...