Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

इस वीडियो के प्रकाशन को My CytoHealth Sdn. Bhd द्वारा समर्थित किया गया था।

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री, उपकरण और सॉफ़्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम सेल और संस्कृति
<ol><li>ड?...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

ईवी एमएससी में स्राव के महत्वपूर्ण उपसमुच्चय में से एक हैं जो सामान्य और रोग प्रक्रियाओं के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, 30 से 200 एनएम के बीच आकार सीमा वाले एसईवी, पिछले दशक में सेल-मुक्त ?...

एमआईएसईवी 2018 के अनुसार, एसईवी गैर-प्रतिकृति लिपिड बाइलेयर कण हैं जिनमें कोई कार्यात्मक नाभिक मौजूद नहीं है, जिसका आकार 30-200 एनएम1 है। एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी में महत्वपूर्ण सिग्नलिंग अणु होते हैं जो ऊतक पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे कि माइक्रोआरएनए, साइटोकिन्स या प्रोटीन। वे पुनर्योजी चिकित्सा और सेल-मुक्त चिकित्सा में तेजी से एक शोध "हॉटस्पॉट" बन गए हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी विभिन्न स्थितियों के इलाज में एमएससी के रूप में प्रभावी हैं, जैसे कि इम्यूनोमॉड्यूलेशन 2,3,4,5, ओस्टियोजेनेसिस6 को बढ़ाना, मधुमेह मेलेटस 7,8, या संवहनी पुनर्जनन 9,10। जैसे-जैसे शुरुआती चरण के परीक्षण आगे बढ़ते हैं, एमएससी-ईवी के नैदानिक अनुवाद के संबंध में तीन मुख्य प्रमुख मुद्दों पर प्रकाश डाला गया है: ईवी की उपज, ईवी की शुद्धता (सेल मलबे और प्रोटीन और साइटोकिन्स जैसे अन्य जैविक दूषित पदार्थों से मुक्त), और अलगाव के बाद ईवी के फॉस्फोलिपिड बाइलेयर झिल्ली की अखंडता।
एसईवी11 के घनत्व, आकार, आकार और सतह प्रोटीन का दोहन करते हुए एसईवी को अलग करने के लिए विभिन्न तरीके विकसित किए गए हैं। एसईवी अलगाव में दो सबसे आम तरीके अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित और अल्ट्राफिल्ट्रेशन-आधारित तकनीकहैं।
अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधियों को एसईवी अलगाव में स्वर्ण मानक तरीके माना जाता है। आमतौर पर नियोजित दो प्रकार की अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन तकनीकें अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन हैं। हालांकि, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधियों के परिणामस्वरूप अक्सर कम उपज होती है और उच्च गति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज (100,000-200,000 × ग्राम) के लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन तकनीक अकेले ईवी उपप्रकारों (एसईवी और बड़े ईवी) को अलग करने में अक्षम हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक अशुद्ध तलछट परत11 होती है। अंत में, घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन भी समय लेने वाला हो सकता है और त्वरण औरमंदी के चरणों के दौरान ढाल क्षति को रोकने के लिए सुक्रोज बफर एडिशन जैसे अतिरिक्त एहतियाती कदमों की आवश्यकता होती है। इसलिए, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन आमतौर पर अपेक्षाकृत कम उपज की ओर जाता है और ईवी13 की विभिन्न आबादी के बीच भेदभाव करने में सक्षम नहीं है, जो बड़े पैमाने पर ईवी तैयारीके लिए इसके आवेदन को सीमित करता है।
ईवी अलगाव की दूसरी विधि अल्ट्राफिल्ट्रेशन के माध्यम से है, जो आकार निस्पंदन पर आधारित है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में अल्ट्राफिल्ट्रेशन अपेक्षाकृत समय और लागत प्रभावी है, क्योंकि इसमें महंगे उपकरण या लंबे प्रसंस्करण समयशामिल नहीं हैं। इसलिए, अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपरोक्त दोनों अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधियों की तुलना में एक अधिक प्रभावी अलगाव तकनीक प्रतीत होती है। पृथक उत्पाद छिद्र आकार और उच्च उपजके आधार पर अधिक विशिष्ट हो सकते हैं। हालांकि, निस्पंदन प्रक्रिया के दौरान किए गए अतिरिक्त बल के परिणामस्वरूप ईवी16 का विरूपण या विस्फोट हो सकता है।
वर्तमान पेपर ने डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी को अलग करने के लिए एक लागत और समय प्रभावी बेंचटॉप प्रोटोकॉल का प्रस्ताव दिया। इस पेपर में वर्णित विधि ने कण आकार विश्लेषण, बायोमार्कर परख और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एचयूसी-एमएससी से उच्च उपज और अच्छी गुणवत्ता वाले ईवी को अलग करने के लिए बेंच टॉप सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ एक सरल निस्पंदन विधि को जोड़ा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित प्रक्रिया को छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) अलगाव के लिए सामान्य विधि माना जाता है। हालांकि, इस अलगाव विधि से उपज अपेक्षाकृत कम है, और ये विधियां एसईवी उपप्रकारों को अलग करने में अक्षम हैं। यह अध्ययन मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं (एचयूसी-एमएससी-एसईवी) को अलग करने के लिए एक सरल बेंचटॉप निस्पंदन विधि को प्रदर्शित करता है, जो एचयूसी-एमएससी के वातानुकूलित माध्यम से अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा सफलतापूर्वक अलग किया जाता है। आकार वितरण, प्रोटीन एकाग्रता, एक्सोसोमल मार्कर (सीडी 9, सीडी 81, टीएसजी 101), और पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी की आकृति विज्ञान को क्रमशः नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, बीसीए प्रोटीन परख, पश्चिमी धब्बा और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था। पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी का आकार 30-200 एनएम था, जिसमें 7.75 × 10 10 कण / एमएल की कण एकाग्रता और80 μg / mL की प्रोटीन एकाग्रता थी। एक्सोसोमल मार्कर सीडी 9, सीडी 81 और टीएसजी 101 के लिए सकारात्मक बैंड देखे गए। इस अध्ययन से पता चला है कि एचयूसी-एमएससी-एसईवी को सफलतापूर्वक एचयूसी-एमएससी वातानुकूलित माध्यम से अलग किया गया था, और लक्षण वर्णन से पता चला है कि पृथक उत्पाद एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स 2018 (एमआईएसईवी 2018) के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी द्वारा उल्लिखित मानदंडों को पूरा करता है।

चित्र 2 से पता चलता है कि एचयूसी-एमएससी-एसईवी में 53 एनएम पर एक कण आकार मोड है, जबकि कण आकार की अन्य महत्वपूर्ण चोटियां 96 और 115 एनएम थीं। एनटीए द्वारा मापा गया एचयूसी-एमएससी-एसईवी की सांद्रता 7.75 × 10<s...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एक सरल प्रयोगशाला-स्केल बेंचटॉप सेटिंग के साथ मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के छोटे बाह्य पुटिकाओं (एचयूसी-एमएससी-एसईवी) को कैसे अलग किया जाए। पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी के आकार वितरण, प्रोटीन एकाग्रता, एसईवी मार्कर और आकृति विज्ञान क्रमशः नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, बीसीए प्रोटीन परख, पश्चिमी धब्बा और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप द्वारा विशेषता है।

मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से छोटे बाह्य पुटिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल बेंचटॉप निस्पंदन विधि

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

यह मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से छोटे बाह्य पुटिकाओं को अलग करने और केंद्रित करने के लिए एक सरल और समय प्रभावी प्रोटोकॉल है। इस तकनीक को अधिकांश प्रयोगशालाओं में अपनाया जाना आसान है क्योंकि यह एक बेंचटॉप स्केल है और संचालन के लिए केवल सरल उपकरणों की आवश्यकता होती है। छोटे बाह्य पुटिकाओं को अलग करने के लिए, हम कम से कम सौ मिलियन कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए बड़े पैमाने पर बढ़ती कोशिकाओं की सलाह देते हैं।यद्यपि यह सरल लगता है, इस तकनीक के कुछ महत्वपूर्ण चरणों को दृश्य प्रदर्शन के माध्यम से बेहतर सूचित किया जाता है। हमें उम्मीद है कि शोधकर्ता हमारे अनुभव से सीख सकते हैं और आत्मविश्वास से कौशल में महारत हासिल कर सकते हैं। हमारे पीएचडी छात्र, श्री चान, हांग हाओ, आपको मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से छोटे बाह्य पुटिकाओं के अलगाव और लक्षण वर्णन में हमारे अनुभव के माध्यम से मार्गदर्शन करेंगे।शुरू करने के लिए, सेल मलबे को हटाने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 ग्राम पर वातानुकूलित माध्यम को सेंट्रीफ्यूज करें। 220 नैनोमीटर से बड़े कणों को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोमीटर फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला को इकट्ठा और फ़िल्टर करें। 0.2 माइक्रोमीटर फ़िल्टर ्ड फॉस्फेट-बफर्ड खारा के 30 मिलीलीटर के साथ एक केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई भरा।फिर केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 3, 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। छानने वाले घोल को छानने वाले कप में फेंक दें। केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई में 70 मिलीलीटर फ़िल्टर किए गए माध्यम जोड़ें और यूनिट को चार डिग्री सेल्सियस पर 3, 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।छानने वाले घोल को छानने वाले कप में फेंक दें। फ़िल्टर किए गए फॉस्फेट-बफर्ड खारा के 30 मिलीलीटर जोड़ें और यूनिट को चार डिग्री सेल्सियस पर 3, 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। फ़िल्टर यूनिट पर एक केंद्रित संग्रह कप स्थापित करें और शुद्ध छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को प्राप्त करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए 1,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज को रिवर्स करें।0.22 माइक्रोमीटर सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छोटे बाह्य पुटिकाओं को फ़िल्टर करें। नमूनों को नए ट्यूबों में स्थानांतरित करें और आगे के विश्लेषण के लिए उन्हें 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण शुरू करने के लिए, फ़िल्टर किए गए फॉस्फेट-बफर्ड खारा में पृथक मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं छोटे बाह्य पुटिकाओं को प्रति फ्रेम 20 से 100 कणों तक पतला करें।एक मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग करके एंटी-ए चैंबर में पतला नमूना के एक मिलीलीटर को पेश करें। तदनुसार माप सेटिंग्स सेट करें। कैमरा स्तर को स्तर 14 पर समायोजित करें।प्रत्येक माप के लिए, मानक माप पर क्लिक करें और तदनुसार कमजोर पड़ने को सेट करें। इसके बाद, कैप्चर पर क्लिक करें, कैमरा शुरू करें, और छोटे ईवी की कल्पना करने के लिए कैमरा स्तर को 14 पर सेट करें। मापन प्रारंभ करने के लिए, बनाएँ क्लिक करें, फिर स्क्रिप्ट चलाएँ क्लिक करें, और उस स्थान का चयन करें जहाँ फ़ाइलें सहेजने की आवश्यकता है.नमूने के आवश्यक विवरण में कुंजी और ठीक पर क्लिक करें। स्क्रिप्ट जारी रखने के लिए सेटिंग ठीक क्लिक करें और माप प्रारंभ करने के लिए ठीक क्लिक करें. एक बार माप दर्ज हो जाने के बाद, प्रति फ्रेम 10 से 100 लाल क्रॉस शामिल करने के लिए पांच की पहचान सीमा के साथ परिणामों का विश्लेषण करें। और ब्लू क्रॉस गिनती पांच तक सीमित है।स्क्रिप्ट जारी रखने और विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए ठीक सेट करें क्लिक करें. स्क्रिप्ट पूर्ण सूचना पर ठीक क्लिक करें और डेटा को सेट स्थान पर निर्यात करने के लिए निर्यात करें। मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को बर्फ के ठंडे रेडियोइम्यूनोप्रेसिपेशन परख लाइसिस बफर के साथ छोटे बाह्य पुटिकाओं को लाइज़ करें और चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें। बीसीए परख का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें। तदनुसार जेल वैद्युतकणसंचलन सेट को इकट्ठा करें और 90 वोल्ट पर जेल वैद्युतकणसंचलन करें जब तक कि प्रोटीन स्टैकिंग जेल के अंत तक नहीं पहुंच जाता।समाधान जेल के अंत तक प्रोटीन को अलग करने के लिए वोल्टेज को 200 वोल्ट में बदलें। एक घंटे के लिए 15 वोल्ट पर जेल से पॉलीविनाइलडिडेन डाइफ्लोराइड झिल्ली में प्रोटीन को स्थानांतरित करने के लिए अर्ध-शुष्क स्थानांतरण करें। कमरे के तापमान पर शेकर पर एक घंटे के लिए ट्राइस-बफर्ड सेलाइन 0.1% ट्वीन 20 में 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को अवरुद्ध करें।पीवीडीएफ झिल्ली को लगातार झटकों के साथ रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर चार डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें। अगले दिन, पीवीडीएफ झिल्ली को टीबीएसटी के साथ पांच बार और पांच मिनट तक धोएं और कमरे के तापमान पर आंदोलन के साथ एक घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें। फिर, पीवीडीएफ झिल्ली को टीबीएसटी के साथ पांच बार धोएं और केमील्यूमिनेसेंट डिटेक्शन अभिकर्मक का उपयोग करके चार्ज-युग्मित इमेजर में झिल्ली की कल्पना करें।इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण करें। सबसे पहले, छवि फ़ाइल को इमेजजे में खोलें। चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करके छवि की गुणवत्ता बढ़ाएं।छवि को तब तक समायोजित करें जब तक कि धब्बे स्पष्ट रूप से दिखाई न दें। लागू करें बटन पर क्लिक करें और छवियों को टीआईएफएफ प्रारूप में सहेजें। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप आधारित विश्लेषण के लिए, मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के एक हिस्से को फ़िल्टर किए गए फॉस्फेट-बफर्ड खारा के चार भागों के साथ छोटे बाह्य पुटिकाओं के नमूने को 10 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में पतला करें और 15 मिनट के लिए कार्बन-लेपित तांबा ग्रिड पर इनक्यूबेट करें।प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त नमूने को हटा दें और इसे तीन मिनट तक हवा में सूखने दें। नमूने को तीन मिनट के लिए दागने के लिए 1% फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड समाधान के 10 माइक्रोलीटर इनक्यूबेट करें। एक प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त 1% फॉस्फोटंगस्टिक एसिड समाधान को हटा दें और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत छवि बनाने के लिए इसे तीन मिनट तक हवा में सूखने दें।मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल छोटे बाह्य पुटिकाओं में 53 नैनोमीटर का कण आकार मोड होता है, जबकि कण आकार की अन्य महत्वपूर्ण चोटियां 96 और 115 नैनोमीटर थीं। एनटीए द्वारा मापा गया मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं की एकाग्रता 7.75 गुना 10 से 10 वें कण प्रति मिलीलीटर थी। बीसीए परख के साथ मापा गया मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं की प्रोटीन एकाग्रता लगभग 80 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर थी।पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण में, मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं ने एक्सोसोमल मार्कर सीडी 9, सीडी 81 और टीएसजी 101 के लिए सकारात्मक बैंड का प्रदर्शन किया, लेकिन जीआरपी 94 के लिए नकारात्मक थे। पृथक मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं को उनके आकार और आकृति विज्ञान को निर्धारित करने के लिए टीईएम के तहत कल्पना की गई थी। मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं छोटे बाह्य पुटिकाओं का आकार लगभग 100 नैनोमीटर था और एक कप जैसी बाईलेयर झिल्ली संरचना दिखाई दी।प्रोटोकॉल के सफल विकास के साथ, अब हम पुनर्योजी दवाओं में छोटे बाह्य पुटिकाओं से प्राप्त मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की चिकित्सीय क्षमता को उजागर कर सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

तटीय समुद्र के पानी के नमूनों की छोटी मात्रा (1-3L) निस्पंदन

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Ferumoxides के आरोपण उपास्थि दोष में मानव mesenchymal स्टेम सेल लेबल

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव कार्डिएक व्यापारियों और cardiomyocytes के कुशल व्युत्पत्ति

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mesenchymal संक्रमण के लिए प्रेरण और उपकला का विश्लेषण

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

वयस्क माउस छेनी से चिकित्सकीय उपकला स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Zebrafish में Nephrotoxin Microinjection गुर्दे की गंभीर चोट मॉडल के लिए

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

न्यूक्लिक एसिड की छानने का अलगाव: एक सरल और तेजी डीएनए निष्कर्षण विधि

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई रणनीतियों को अलग करने और शुद्ध श्लेष द्रव-व्युत्पंन Mesenchymal एक खरगोश मॉडल से स्टेम कोशिकाओं

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

माउस से सेरेब्रल पेरिसाइट्स को अलग करने के लिए एक उच्च आउटपुट विधि

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

एस्चेरिचिया कोलाई और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...