Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

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NOTA: vedere la tabella dei materiali per informazioni dettagliate su tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano e coltura
<ol><li>Coltura delle hUC-MSC ad una densità di semina di 5 × 103/cm2 in DMEM, integrata con lisato piastrinico umano all'8% e penna strep all'1%. Incubare le cellule a 37 °C in 5% di CO2. Sostituire i...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

Le EV sono uno dei sottoinsiemi importanti del secretoma nelle MSC che svolgono un ruolo cruciale durante i processi normali e patologici. Tuttavia, le sEV, con un intervallo di dimensioni comprese tra 30 e 200 nm, sono aumentate come potenziale strumento per la terapia senza cellule negli ultimi dieci anni. Sono state sviluppate varie tecniche per isolare i sEV dalle MSC. Tuttavia, l'ultracentrifugazione differenziale, l'ultrafiltrazione, la precipitazione a base di polimeri, la cattura di immunoaffinità e la precipita...

Secondo MISEV 2018, le sEV sono particelle lipidiche a doppio strato non replicanti senza nucleo funzionale presente, con una dimensione di 30-200 nm1. Le sEV derivate da MSC contengono importanti molecole di segnalazione che svolgono un ruolo importante nella rigenerazione dei tessuti, come microRNA, citochine o proteine. Sono diventati sempre più un "hotspot" di ricerca nella medicina rigenerativa e nella terapia cell-free. Molti studi hanno dimostrato che le sEV derivate da MSC sono efficaci quanto le MSC nel trattamento di diverse condizioni, come l'immunomodulazione 2,3,4,5, il miglioramento dell'osteogenesi 6, il diabete mellito7,8 o la rigenerazione vascolare 9,10. Con il progredire degli studi di fase iniziale, sono state evidenziate tre questioni chiave principali in relazione alla traduzione clinica delle MSC-EV: la resa delle EV, la purezza delle EV (esenti da detriti cellulari e altri contaminanti biologici come proteine e citochine) e l'integrità della membrana fosfolipidica a doppio strato delle EV dopo l'isolamento.
Sono stati sviluppati vari metodi per isolare i sEV, sfruttando la densità, la forma, le dimensioni e le proteine di superficie dei sEV11. I due metodi più comuni nell'isolamento dei veicoli elettrici sono tecniche basate sull'ultracentrifugazione e sull'ultrafiltrazione.
I metodi basati sull'ultracentrifugazione sono considerati metodi gold standard nell'isolamento dei sEV. Due tipi di tecniche di ultracentrifugazione che vengono solitamente impiegate sono l'ultracentrifugazione differenziale e l'ultracentrifugazione a gradiente di densità. Tuttavia, i metodi di ultracentrifugazione spesso comportano una bassa resa e richiedono costose attrezzature per l'ultracentrifuga ad alta velocità (100.000-200.000 × g)11. Inoltre, le tecniche di ultracentrifugazione da sole sono inefficienti nel separare i sottotipi di EV (sEV e grandi EV), risultando in uno strato di sedimenti impuri11. Infine, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità potrebbe anche richiedere molto tempo e richiedere ulteriori misure precauzionali come l'aggiunta di tampone di saccarosio per inibire il danno del gradiente durante le fasi di accelerazione e decelerazione12. Pertanto, l'ultracentrifugazione di solito porta a una resa relativamente bassa e non è in grado di discriminare tra diverse popolazioni di EV13, il che limita la sua applicazione per la preparazione di EV su larga scala11.
Il secondo metodo di isolamento EV è tramite ultrafiltrazione, che si basa sulla filtrazione dimensionale. L'ultrafiltrazione è relativamente efficiente in termini di tempo e costi rispetto all'ultracentrifugazione, in quanto non comporta attrezzature costose o lunghi tempi di lavorazione14. Quindi, l'ultrafiltrazione sembra essere una tecnica di isolamento più efficace di entrambi i suddetti metodi di ultracentrifugazione. I prodotti isolati possono essere più specifici in base alle dimensioni dei pori e alla maggiore resa15. Tuttavia, la forza aggiuntiva sostenuta durante il processo di filtrazione può provocare la deformazione o l'eruzione dei veicoli elettrici16.
Il presente documento ha proposto un protocollo da banco economico e tempestivo per isolare i sEV derivati da MSC per l'analisi a valle e scopi terapeutici. Il metodo descritto in questo documento ha combinato un semplice metodo di filtrazione con centrifugazione da banco per isolare EV ad alto rendimento e di buona qualità da hUC-MSC per l'analisi a valle, compresa l'analisi delle dimensioni delle particelle, il saggio dei biomarcatori e l'imaging al microscopio elettronico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

Il processo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il metodo comune per l'isolamento di piccole vescicole extracellulari (sEV). Tuttavia, la resa di questo metodo di isolamento è relativamente inferiore e questi metodi sono inefficienti nel separare i sottotipi sEV. Questo studio dimostra un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare le piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEVs), separate con successo mediante ultrafiltrazione dal mezzo condizionato di hUC-MSC. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori esosomici (CD9, CD81, TSG101) e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono stati caratterizzati rispettivamente con analisi di tracciamento delle nanoparticelle, saggio della proteina BCA, western blot e microscopio elettronico a trasmissione. La dimensione degli hUC-MSC-sEV isolati era di 30-200 nm, con una concentrazione di particelle di 7,75 × 10 10 particelle/ml e una concentrazione proteica di80 μg/mL. Sono state osservate bande positive per i marcatori esosomici CD9, CD81 e TSG101. Questo studio ha dimostrato che gli hUC-MSC-sEV sono stati isolati con successo dal mezzo condizionato da hUC-MSCs e la caratterizzazione ha mostrato che il prodotto isolato soddisfaceva i criteri menzionati da Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

La Figura 2 mostra che gli hUC-MSC-sEV hanno una modalità di dimensione delle particelle a 53 nm, mentre altri picchi significativi di dimensione delle particelle erano 96 e 115 nm. La concentrazione di hUC-MSC-sEV misurata da NTA era 7,75 × 1010 particelle/ml. La concentrazione proteica di hUC-MSC-sEVs misurata con il test BCA era di circa 80 μg/ml.
Nell'analisi western blotting, gli hUC-MSC-sEV hanno dimostrato bande positive per i marcatori esosom...

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A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Questo protocollo dimostra come isolare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEV) con una semplice impostazione da banco su scala di laboratorio. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori sEVs e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono caratterizzati rispettivamente dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal saggio della proteina BCA, dal western blot e dal microscopio elettronico a trasmissione.

Un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Questo è un protocollo semplice ed efficace in termini di tempo per isolare e concentrare piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali. Questa tecnica è facile da adottare nella maggior parte dei laboratori in quanto è una bilancia da banco e richiede solo strumenti semplici per le operazioni. Per isolare una delle piccole vescicole extracellulari, raccomandiamo di far crescere le cellule su larga scala per ottenere un minimo di centinaia di milioni di cellule.Anche se sembra semplice, alcuni passaggi critici di questa tecnica sono meglio informati attraverso la dimostrazione visiva. Speriamo che i ricercatori possano imparare dalla nostra esperienza e padroneggiare le competenze con sicurezza. Il nostro dottorando, Mr.Chan, Hong Hao, ti guiderà attraverso la nostra esperienza nell'isolamento e nella caratterizzazione di piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali.Per iniziare, centrifugare il mezzo condizionato a 200 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere e filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 micrometri per rimuovere particelle più grandi di 220 nanometri. Riempito un gruppo filtrante centrifugo con 30 millilitri di soluzione salina filtrata con tampone fosfato filtrato da 0,2 micrometri.Quindi centrifugare l'unità filtrante centrifuga a 3.500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Aggiungere 70 millilitri di mezzo filtrato condizionato nell'unità filtrante centrifuga e centrifugare l'unità a 3.500 g a quattro gradi Celsius.Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Aggiungere 30 millilitri di soluzione salina filtrata tamponata con fosfato e centrifugare l'unità a 3.500 g a quattro gradi Celsius. Installare un bicchiere di raccolta del concentrato sull'unità filtrante e centrifugare inversamente a 1.000 g per due minuti a quattro gradi Celsius per ottenere le piccole vescicole extracellulari purificate.Filtrare le piccole vescicole extracellulari attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri. Trasferire i campioni in nuove provette e conservarli a 80 gradi Celsius per ulteriori analisi. Per iniziare l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, diluire le piccole vescicole extracellulari isolate delle cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale umano in soluzione salina filtrata tamponata con fosfato a 20-100 particelle per fotogramma.Introdurre un millilitro del campione diluito nella camera anti-A utilizzando siringhe monouso da un millilitro. Impostare le impostazioni di misurazione di conseguenza. Regolare il livello della videocamera al livello 14.Per ogni misurazione, fare clic sulla misurazione standard e impostare la diluizione di conseguenza. Quindi, fai clic su Acquisisci, Avvia fotocamera e imposta il livello della fotocamera su 14 per visualizzare i piccoli veicoli elettrici. Per avviare la misurazione, fare clic su Crea, quindi su Esegui script e selezionare la posizione in cui salvare i file.Digitare i dettagli necessari dell'esempio e fare clic su OK. Fare clic sull'impostazione OK per continuare lo script e fare clic su OK per avviare la misurazione. Una volta registrata la misurazione, analizza i risultati con una soglia di rilevamento di cinque per includere da 10 a 100 croci rosse per fotogramma. E il conteggio delle croci blu è limitato a cinque.Fare clic su Impostazione OK per continuare lo script e avviare l'analisi. Fare clic su OK nella notifica di completamento dello script ed esportare per esportare i dati nella posizione impostata. Lisare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano con tampone di lisi per il saggio di radioimmunoprecipitazione ghiacciata e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Raccogliere il surnatante dopo aver centrifugato a 200g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quantificare la proteina utilizzando un test BCA. Assemblare il set di elettroforesi su gel di conseguenza ed eseguire l'elettroforesi su gel a 90 volt fino a quando la proteina raggiunge l'estremità del gel impilabile.Cambiare la tensione a 200 volt per separare le proteine fino alla fine del gel risolutivo. Eseguire il trasferimento semi-secco per trasferire le proteine dal gel a una membrana di difluoruro di polivinilidene a 15 volt per un'ora. Bloccare la membrana PVDF con albumina sierica bovina al 3% in soluzione salina tamponata tris 0,1%Tween 20 per un'ora su uno shaker a temperatura ambiente.Incubare la membrana PVDF con anticorpi primari a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione costante. Il giorno successivo, lavare la membrana PVDF cinque volte e cinque minuti ciascuno con TBST e incubare ulteriormente con un anticorpo secondario per un'ora con agitazione a temperatura ambiente. Anche in questo caso, lavare la membrana PVDF con TBST cinque volte e visualizzare la membrana in un imager ad accoppiamento di carica utilizzando un reagente di rilevamento chemiluminescente.Analizzare il livello di espressione delle proteine utilizzando il software ImageJ. Innanzitutto, apri il file di immagine in ImageJ. Migliora la qualità dell'immagine regolando la luminosità e il contrasto.Regolare l'immagine fino a quando le macchie sono chiaramente visibili. Fare clic sul pulsante Applica e salvare le immagini in formato TIFF. Per l'analisi basata sul microscopio elettronico a trasmissione, diluire una parte del campione di piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano con quattro parti di soluzione salina filtrata tamponata con fosfato per un volume totale di 10 microlitri e incubare su una griglia di rame rivestita di carbonio per 15 minuti.Rimuovere il campione in eccesso con una salvietta da laboratorio e lasciarlo asciugare all'aria per tre minuti. Incubare 10 microlitri di soluzione di acido fosfotungstico all'1% per macchiare il campione per tre minuti. Rimuovere la soluzione di acido fosfotungstico all'1% in eccesso utilizzando una salvietta da laboratorio e lasciarla asciugare all'aria per tre minuti per l'immagine al microscopio elettronico a trasmissione.Le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano hanno una modalità granulometrica di 53 nanometri, mentre altri picchi significativi di dimensione delle particelle erano 96 e 115 nanometri. La concentrazione di piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano misurata da NTA era 7,75 volte da 10 a 10 particelle per millilitro. La concentrazione proteica delle piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano misurata con il test BCA era di circa 80 microgrammi per millilitro.Nell'analisi western blotting, le piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano hanno dimostrato bande positive per i marcatori esosomici CD9, CD81 e TSG101, ma erano negative per GRP94. Le piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano isolate sono state visualizzate sotto TEM per determinarne le dimensioni e la morfologia. Le cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale umano piccole vescicole extracellulari hanno dimensioni di circa 100 nanometri e hanno mostrato una struttura a membrana a doppio strato simile a una coppa.Con il successo dello sviluppo del protocollo, possiamo ora scoprire le potenzialità terapeutiche delle cellule staminali mesenchimali derivate da piccole vescicole extracellulari nelle medicine rigenerative.

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