Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Publiseringen av denne videoen ble støttet av My CytoHealth Sdn. Bhd.

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Human navlestreng, mesenkymale stamceller og kultur
<ol><li>Dyrkning av hUC-MSC ved en såtetthet på 5 × 103/cm2 i DMEM, supplert med 8 % humant blodplatelysat og 1 % pen-streptokokker. Inkuber cellene ved 37 °C i 5% CO2. Bytt ut cellekulturmediet hver 3. dag for å sikre riktig cellevekst.</li>
	<li>Utvi...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

Elbiler er en av de viktige undergruppene av sekretomet i MSC som spiller en avgjørende rolle under normale og patologiske prosesser. Imidlertid har sEV, med et størrelsesområde mellom 30 og 200 nm, steget som et potensielt verktøy for cellefri terapi det siste tiåret. Ulike teknikker ble utviklet for å isolere sEV-er fra MSC-er. Imidlertid har differensiell ultrasentrifugering, ultrafiltrering, polymerbasert nedbør, immunoaffinitetsfangst og mikrofluidikkbasert nedbør forskjellige fordeler og ulemper<sup class="...

I følge MISEV 2018 er sEV ikke-replikerende lipid-dobbeltlagspartikler uten funksjonell kjerne tilstede, med en størrelse på 30-200 nm1. MSC-avledede sEV-er inneholder viktige signalmolekyler som spiller viktige roller i vevregenerering, for eksempel mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har i økende grad blitt et forsknings-"hotspot" innen regenerativ medisin og cellefri terapi. Mange studier har vist at MSC-avledede sEV-er er like effektive som MSC ved behandling av forskjellige forhold, for eksempel immunmodulering 2,3,4,5, forsterkende osteogenese 6, diabetes mellitus 7,8 eller vaskulær regenerering 9,10. Etter hvert som forsøkene i tidlig fase skrider frem, har tre hovednøkkelspørsmål i forhold til den kliniske oversettelsen av MSC-EV-er blitt fremhevet: utbyttet av elbilene, renheten til elbilene (fri for cellerester og andre biologiske forurensninger som protein og cytokiner) og integriteten til fosfolipid-dobbeltlagsmembranen til elbilene etter isolering.
Ulike metoder har blitt utviklet for å isolere sEVs, utnytte tettheten, formen, størrelsen og overflateproteinet til sEVs11. De to vanligste metodene i sEV-isolasjoner er ultrasentrifugeringsbaserte og ultrafiltreringsbaserte teknikker.
Ultrasentrifugeringsbaserte metoder regnes som gullstandardmetoder i sEVs isolasjon. To typer ultracentrifugation teknikker som vanligvis brukes er differensiell ultracentrifugation og tetthet gradient ultracentrifugation. Imidlertid resulterer ultrasentrifugeringsmetoder ofte i lavt utbytte og krever dyrt utstyr for høyhastighets ultrasentrifuge (100.000-200.000 × g)11. Videre er ultrasentrifugeringsteknikker alene ineffektive for å separere EV-subtyper (sEV og store EV), noe som resulterer i et urent sedimentlag11. Til slutt kan ultrasentrifugering av tetthetsgradient også være tidkrevende og kreve ytterligere forholdsregler som sukrosebuffertillegg for å hemme gradientskaden under akselerasjon og retardasjonstrinn12. Derfor fører ultrasentrifugering vanligvis til et relativt lavt utbytte og er ikke i stand til å diskriminere mellom forskjellige populasjoner av EV13, noe som begrenser søknaden om storskala EV-forberedelse11.
Den andre metoden for EV-isolasjon er via ultrafiltrering, som er basert på størrelsesfiltrering. Ultrafiltrering er relativt tids- og kostnadseffektivt sammenlignet med ultrasentrifugering, da det ikke innebærer dyrt utstyr eller lang saksbehandlingstid14. Derfor synes ultrafiltrering å være en mer effektiv isolasjonsteknikk enn begge de nevnte ultrasentrifugeringsmetodene. De isolerte produktene kan være mer spesifikke basert på porestørrelser og høyere utbytte15. Den ekstra kraften som påløper under filtreringsprosessen kan imidlertid føre til deformasjon eller utbrudd av elbilene16.
Det nåværende papiret foreslo en kostnads- og tidseffektiv benchtop-protokoll for isolering av MSC-avledede sEV-er for nedstrømsanalyse og terapeutiske formål. Metoden beskrevet i dette papiret kombinerte en enkel filtreringsmetode med benksentrifugering for å isolere høy avkastning og god kvalitet EV fra hUC-MSCs for nedstrømsanalyse, inkludert partikkelstørrelsesanalyse, biomarkøranalyse og elektronmikroskopisk avbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

Den ultrasentrifugeringsbaserte prosessen regnes som den vanlige metoden for isolasjon av små ekstracellulære vesikler (sEVs). Utbyttet fra denne isolasjonsmetoden er imidlertid relativt lavere, og disse metodene er ineffektive for å skille sEV-undertyper. Denne studien demonstrerer en enkel stasjonær filtreringsmetode for å isolere MSC små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) fra mennesker, vellykket separert ved ultrafiltrering fra det kondisjonerte mediet til hUC-MSC. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, eksosomale markører (CD9, CD81, TSG101) og morfologien til de isolerte hUC-MSC-sEVene ble karakterisert med henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop. De isolerte hUC-MSC-sEVs størrelse var 30-200 nm, med en partikkelkonsentrasjon på 7,75 × 10 10 partikler/ml og en proteinkonsentrasjon på80 μg/ml. Positive bånd for eksosomale markører CD9, CD81 og TSG101 ble observert. Denne studien viste at hUC-MSC-sEVs ble vellykket isolert fra hUC-MSCs betingede medium, og karakterisering viste at det isolerte produktet oppfylte kriteriene nevnt av Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Figur 2 viser at hUC-MSC-sEV har en partikkelstørrelsesmodus ved 53 nm, mens andre signifikante topper av partikkelstørrelse var 96 og 115 nm. Konsentrasjonen av hUC-MSC-sEVs målt av NTA var 7,75 × 1010 partikler/ml. Proteinkonsentrasjonen av hUC-MSC-sEVs målt med BCA-analysen var ca. 80 μg / ml.
I vestlig blottinganalyse viste hUC-MSC-sEV positive bånd for eksosommarkørene CD9, CD81 og TSG101, men var negative for GRP94 (fi...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Denne protokollen demonstrerer hvordan man isolerer humane navlestrengsavledede mesenkymale stamcellers små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) med en enkel benkeplateinnstilling i laboratorieskala. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, sEVs markører og morfologi av isolerte hUC-MSC-sEVs er preget av henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop.

En enkel stasjonær filtreringsmetode for å isolere små ekstracellulære vesikler fra humane mesenkymale stamceller

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Dette er en enkel og tidseffektiv protokoll for å isolere og konsentrere små ekstracellulære vesikler fra mesenkymale stamceller. Denne teknikken er lett å bli vedtatt i de fleste laboratorier, da det er en benchtop-skala og bare krever enkle instrumenter for operasjoner. For å isolere en av små ekstracellulære vesikler, anbefaler vi å dyrke celler i stor skala for å oppnå minst hundre millioner celler.Selv om det høres enkelt ut, er visse kritiske trinn i denne teknikken bedre informert gjennom visuell demonstrasjon. Vi håper forskerne kan lære av vår erfaring og mestre ferdighetene på en trygg måte. Vår doktorgradsstudent, Mr.Chan, Hong Hao, vil veilede deg gjennom vår erfaring med isolering og karakteriseringer av små ekstracellulære vesikler fra mesenkymale stamceller.For å begynne, sentrifuger det kondisjonerte mediet ved 200g i fem minutter ved fire grader Celsius for å fjerne celleavfall. Samle og filtrer supernatanten gjennom et 0,22 mikrometer filter for å fjerne partikler større enn 220 nanometer. Fylt en sentrifugalfilterenhet med 30 ml 0,2 mikrometer filtrert fosfatbufret saltvann.Sentrifuge deretter sentrifugalfilterenheten ved 3.500g i fem minutter ved fire grader Celsius. Kast oppløsningen i filtratoppløsningskoppen. Tilsett 70 ml filtrert betinget medium inn i sentrifugalfilterenheten og sentrifuge enheten ved 3.500g ved fire grader Celsius.Kast oppløsningen i filtratoppløsningskoppen. Tilsett 30 ml filtrert fosfatbufret saltvann og sentrifuge enheten ved 3.500g ved fire grader Celsius. Monter en konsentratoppsamlingskopp på filterenheten og omvendt sentrifuge ved 1.000g i to minutter ved fire grader Celsius for å oppnå de rensede små ekstracellulære vesiklene.Filtrer de små ekstracellulære vesiklene gjennom et 0,22 mikrometer sprøytefilter. Overfør prøvene til nye rør og lagre dem ved 80 grader Celsius for videre analyse. For å starte nanopartikkelsporingsanalyse, fortynn de isolerte humane navlestrengsavledede mesenkymale stamceller små ekstracellulære vesikler i filtrert fosfatbufret saltvann til 20 til 100 partikler per ramme.Innfør en milliliter av den fortynnede prøven inn i anti-A-kammeret ved hjelp av en milliliter engangssprøyter. Angi måleinnstillingene i henhold til dette. Juster kameranivået til nivå 14.For hver måling klikker du på standardmålingen og stiller fortynningen i henhold til dette. Deretter klikker du på Capture, Start Camera og setter kameranivået til 14 for å visualisere de små elbilene. Hvis du vil starte målingen, klikker du på Opprett, klikker deretter på Kjør skript og velger plasseringen der filene må lagres.Tast inn de nødvendige detaljene i prøven og klikk OK. Klikk på innstillingen OK for å fortsette skriptet, og klikk OK for å starte målingen. Når målingen er registrert, analyser resultatene med en deteksjonsterskel på fem for å inkludere 10 til 100 røde kryss per ramme. Og antallet blå kors er begrenset til fem.Klikk Innstilling OK for å fortsette skriptet og starte analysen. Klikk OK på skriptet fullføre varsling og eksport for å eksportere dataene til den angitte plasseringen. Lyse de humane navlestrengsavledede mesenkymale stamcellene, små ekstracellulære vesikler med iskald radioimmunoprecipitasjonsanalyse, lysisbuffer og inkubere i 30 minutter ved fire grader Celsius.Samle supernatanten etter sentrifugering ved 200g i fem minutter ved fire grader Celsius. Kvantifiser proteinet ved hjelp av en BCA-analyse. Monter gelelektroforesesettet tilsvarende og utfør gelelektroforese ved 90 volt til proteinet når stablingsgelens ende.Endre spenningen til 200 volt for å skille proteinene til slutten av oppløsningsgelen. Utfør halvtørr overføring for å overføre proteinene fra gelen til en polyvinylidendifluoridmembran ved 15 volt i en time. Blokker PVDF-membranen med 3% bovint serumalbumin i trisbufret saltvann 0,1% mellom 20 i en time på en shaker ved romtemperatur.Inkuber PVDF-membranen med primære antistoffer ved fire grader Celsius over natten med konstant risting. Neste dag, vask PVDF-membranen fem ganger og fem minutter hver med TBST og inkuber videre med et sekundært antistoff i en time med omrøring ved romtemperatur. Igjen, vask PVDF-membranen med TBST fem ganger og visualiser membranen i et ladningskoblet bildeapparat ved hjelp av et kjemiluminescerende deteksjonsreagens.Analyser ekspresjonsnivået til proteinene ved hjelp av ImageJ-programvare. Først åpner du bildefilen i ImageJ. Forbedre kvaliteten på bildet ved å justere lysstyrken og kontrasten.Juster bildet til flekkene er godt synlige. Klikk på Bruk-knappen og lagre bildene i TIFF-format. For transmisjonselektronmikroskopbasert analyse, fortynn en del av den humane navlestrengsavledede mesenkymale stamceller små ekstracellulære vesikler prøve med fire deler filtrert fosfatbufret saltvann til et totalt volum på 10 mikroliter og inkubere på et karbonbelagt kobbergitter i 15 minutter.Fjern overflødig prøve ved hjelp av en laboratorieserviett og la den lufttørke i tre minutter. Inkuber 10 mikroliter 1% fosfotungstisk syreoppløsning for å flekke prøven i tre minutter. Fjern overflødig 1% fosfotungstic acid løsning ved hjelp av et laboratorium tørke og la den lufttørke i tre minutter til bildet under en overføring elektronmikroskop.Humane navlestrengsavledede mesenkymale stamceller små ekstracellulære vesikler har en partikkelstørrelsesmodus på 53 nanometer, mens andre signifikante topper av partikkelstørrelse var 96 og 115 nanometer. Konsentrasjonen av humane navlestrengsavledede MSC små ekstracellulære vesikler målt av NTA var 7, 75 ganger 10 til 10. partikler per milliliter. Proteinkonsentrasjonen av MSC små ekstracellulære vesikler fra humane navlestreng målt med BCA-analysen var ca. 80 mikrogram per milliliter.I vestlig blottinganalyse viste MSC små ekstracellulære vesikler fra human navlestreng positive bånd for eksosomale markører CD9, CD81 og TSG101, men var negative for GRP94. De isolerte humane navlestrengsavledede MSC små ekstracellulære vesiklene ble visualisert under TEM for å bestemme deres størrelse og morfologi. Humane navlestrengsavledede mesenkymale stamceller, små ekstracellulære vesikler dimensjonerte ca. 100 nanometer og viste en kopplignende tolags membranstruktur.Med den vellykkede utviklingen av protokollen kan vi nå avdekke de terapeutiske potensialene til mesenkymale stamceller avledet små ekstracellulære vesikler i regenerative medisiner.

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyrer: En enkel og Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktivert celle sortering strategier for å isolere og rense Synovial Fluid-avledet Mesenchymal stamceller fra en kanin modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

En høy output metode for å isolere cerebral Pericytes fra Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...