Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

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NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos e software usados neste protocolo.
1. Células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano e cultura
<ol><li>Cultivar as CTMs-hUC na densidade de semeadura de 5 × 103/cm2 em DMEM, suplementada com 8% de lisado plaquetário humano e 1% de caneta-Strep. Incubar as células a 37 °C em 5% de CO2. Substitua o meio de cultura celul...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

Os EVs são um dos subgrupos importantes do secretoma nas CTMs que desempenham um papel crucial durante processos normais e patológicos. No entanto, os sEVs, com uma faixa de tamanho entre 30 e 200 nm, surgiram como uma ferramenta potencial para terapia livre de células na última década. Várias técnicas foram desenvolvidas para isolar sEVs de CTMs. Entretanto, ultracentrifugação diferencial, ultrafiltração, precipitação à base de polímero, captura de imunoafinidade e precipitação baseada em microfluídica...

De acordo com o MISEV 2018, sEVs são partículas de bicamada lipídica não replicantes sem núcleo funcional presente, com um tamanho de 30-200 nm1. Os sEVs derivados de CTM contêm moléculas sinalizadoras importantes que desempenham papéis importantes na regeneração tecidual, como microRNA, citocinas ou proteínas. Eles têm se tornado cada vez mais um "hotspot" de pesquisa em medicina regenerativa e terapia livre de células. Muitos estudos têm demonstrado que as EVs derivadas das CTM são tão eficazes quanto as CTMs no tratamento de diferentes condições, como imunomodulação2,3,4,5, potencialização da osteogênese6, diabetes mellitus7,8ou regeneração vascular9,10. À medida que os ensaios de fase inicial avançam, três questões-chave principais em relação à tradução clínica das CTMs-EVs têm sido destacadas: o rendimento dos EVs, a pureza dos EVs (livres de restos celulares e outros contaminantes biológicos, como proteínas e citocinas) e a integridade da membrana bicamada fosfolipídica dos EVs após o isolamento.
Vários métodos têm sido desenvolvidos para isolar os sEVs, explorando a densidade, forma, tamanho e proteína de superfície dos sEVs11. Os dois métodos mais comuns em isolamentos de sEVs são técnicas baseadas em ultracentrifugação e técnicas baseadas em ultrafiltração.
Métodos baseados em ultracentrifugação são considerados métodos padrão-ouro no isolamento de sEVs. Dois tipos de técnicas de ultracentrifugação que são usualmente empregadas são a ultracentrifugação diferencial e a ultracentrifugação por gradiente de densidade. No entanto, os métodos de ultracentrifugação frequentemente resultam em baixo rendimento e requerem equipamentos caros para ultracentrifugação de alta velocidade (100.000-200.000 × g)11. Além disso, as técnicas de ultracentrifugação isoladamente são ineficientes na separação dos subtipos de EV (sEVs e grandes EVs), resultando em uma camada de sedimento impura11. Por fim, a ultracentrifugação por gradiente de densidade também pode ser demorada e exigir precauções adicionais, como a adição de tampão de sacarose para inibir o dano do gradiente durante as etapas de aceleração e desaceleração12. Assim, a ultracentrifugação geralmente leva a um rendimento relativamente baixo e não é capaz de discriminar diferentes populações de EVs13, o que limita sua aplicação para a preparação em larga escala de EV11.
O segundo método de isolamento de EV é via ultrafiltração, que é baseada na filtração de tamanho. A ultrafiltração é relativamente eficaz em termos de tempo e custo em comparação com a ultracentrifugação, pois não envolve equipamentos caros ou longos tempos de processamento14. Assim, a ultrafiltração parece ser uma técnica de isolamento mais eficaz do que os dois métodos de ultracentrifugação já mencionados. Os produtos isolados podem ser mais específicos com base no tamanho dos poros e maior rendimento15. No entanto, a força adicional incorrida durante o processo de filtração pode resultar na deformação ou erupção dos EVs16.
O presente artigo propôs um protocolo de bancada custo-efetivo e tempo-efetivo para isolar sEVs derivadas de CTM para análise a jusante e fins terapêuticos. O método descrito neste artigo combinou um método de filtração simples com centrifugação de bancada para isolar EVs de alto rendimento e boa qualidade de hUC-MSCs para análise a jusante, incluindo análise de tamanho de partículas, ensaio de biomarcadores e imagens por microscopia eletrônica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

O processo baseado em ultracentrifugação é considerado o método comum para o isolamento de pequenas vesículas extracelulares (EVs). No entanto, o rendimento desse método de isolamento é relativamente menor, e esses métodos são ineficientes na separação dos subtipos de sEV. Este estudo demonstra um método simples de filtração de bancada para isolar pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas com sucesso por ultrafiltração do meio condicionado de hUC-MSCs. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores exossômicos (CD9, CD81, TSG101) e morfologia dos hUC-MSC-sEVs isolados foram caracterizados com análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente. O tamanho das hUC-MSC-sEVs isoladas foi de 30-200 nm, com concentração de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/mL e concentração proteica de80 μg/mL. Bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101 foram observadas. Este estudo mostrou que hUC-MSC-sEVs foram isolados com sucesso do meio condicionado hUC-MSCs, e a caracterização mostrou que o produto isolado preencheu os critérios mencionados pelo Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

A Figura 2 mostra que hUC-MSC-sEVs têm um modo de tamanho de partícula em 53 nm, enquanto outros picos significativos de tamanho de partícula foram 96 e 115 nm. A concentração de hUC-MSC-sEVs medida por NTA foi de 7,75 × 1010 partículas/mL. A concentração proteica de hUC-MSC-sEVs medida com o ensaio de BCA foi de aproximadamente 80 μg/mL.
Na análise de western blotting, hUC-MSC-sEVs demonstraram bandas positivas para os marcadores exossômico...

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A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.

Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Este é um protocolo simples e eficaz em termos de tempo para isolar e concentrar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais. Esta técnica é fácil de ser adotada na maioria dos laboratórios, pois é uma balança de bancada e requer apenas instrumentos simples para operações. Para isolar uma das pequenas vesículas extracelulares, recomendamos o crescimento de células em larga escala para obter um mínimo de cem milhões de células.Embora pareça simples, alguns passos críticos dessa técnica são melhor informados por meio da demonstração visual. Esperamos que os pesquisadores possam aprender com nossa experiência e dominar as habilidades com confiança. Nosso aluno de doutorado, Sr.Chan, Hong Hao, irá guiá-lo através de nossa experiência em isolamento e caracterizações de pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais.Para começar, centrifugar o meio condicionado a 200g por cinco minutos a quatro graus Celsius para remover detritos celulares. Coletar e filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 micrômetro para remover partículas maiores que 220 nanômetros. Encheu uma unidade de filtro centrífugo com 30 mililitros de solução salina tamponada com fosfato filtrado de 0,2 micrômetro.Em seguida, centrifugar a unidade de filtro centrífugo a 3.500g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Adicione 70 mililitros de meio condicionado filtrado na unidade de filtro centrífugo e centrifugue a unidade a 3.500g a quatro graus Celsius.Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Adicione 30 mililitros de solução salina tamponada com fosfato filtrado e centrifugar a unidade a 3.500g a quatro graus Celsius. Instale um copo coletor de concentrado na unidade filtrante e centrífuga reversa a 1.000g por dois minutos a quatro graus Celsius para obter as pequenas vesículas extracelulares purificadas.Filtrar as pequenas vesículas extracelulares através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Transfira as amostras para novos tubos e armazene-as a 80 graus Celsius para análise posterior. Para iniciar a análise de rastreamento de nanopartículas, dilua as células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano isoladas de pequenas vesículas extracelulares em solução salina tamponada com fosfato filtrado para 20 a 100 partículas por quadro.Introduzir um mililitro da amostra diluída na câmara anti-A utilizando seringas descartáveis de um mililitro. Defina as configurações de medição de acordo. Ajuste o nível da câmera para o nível 14.Para cada medição, clique na medida padrão e defina a diluição de acordo. Em seguida, clique em Capturar, Iniciar câmera e defina o Nível da câmera como 14 para visualizar os pequenos EVs. Para iniciar a medição, clique em Criar, em Executar Script e selecione o local onde os arquivos precisam ser salvos.Digite os detalhes necessários do exemplo e clique em OK. Clique na configuração OK para continuar o script e clique em OK para iniciar a medição. Uma vez que a medição tenha sido registrada, analise os resultados com um limiar de detecção de cinco para incluir 10 a 100 cruzes vermelhas por quadro. E a contagem de cruzes azuis é limitada a cinco.Clique em Configuração OK para continuar o script e iniciar a análise. Clique em OK na notificação de conclusão do script e exporte para exportar os dados para o local definido. Lisar as células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano, pequenas vesículas extracelulares com tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação gelada e incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius.Recolher o sobrenadante após centrifugar a 200g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Quantificar a proteína usando um ensaio de BCA. Monte a eletroforese em gel ajustada de acordo e realize a eletroforese em gel a 90 volts até que a proteína atinja o final do gel de empilhamento.Mude a tensão para 200 volts para separar as proteínas até o final do gel de resolução. Realizar transferência semi-seca para transferir as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno a 15 volts por uma hora. Bloquear a membrana de PVDF com albumina de soro bovino a 3% em solução salina tamponada a 0,1% Tween 20 por uma hora em agitador à temperatura ambiente.Incubar a membrana de PVDF com anticorpos primários a quatro graus Celsius durante a noite com agitação constante. No dia seguinte, lavar a membrana de PVDF cinco vezes e cinco minutos cada com TBST e incubar com um anticorpo secundário por uma hora com agitação à temperatura ambiente. Novamente, lave a membrana de PVDF com TBST cinco vezes e visualize a membrana em um imageador acoplado à carga usando um reagente de detecção quimioluminescente.Analise o nível de expressão das proteínas utilizando o software ImageJ. Primeiro, abra o arquivo de imagem no ImageJ. Melhore a qualidade da imagem ajustando o brilho e o contraste.Ajuste a imagem até que as manchas fiquem claramente visíveis. Clique no botão Aplicar e salve as imagens no formato TIFF. Para análise baseada em microscópio eletrônico de transmissão, diluir uma parte da amostra de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano de pequenas vesículas extracelulares com quatro partes de solução salina tamponada com fosfato filtrado para um volume total de 10 microlitros e incubar em uma grade de cobre revestida de carbono por 15 minutos.Retire o excesso de amostra usando um lenço de laboratório e deixe secar ao ar por três minutos. Incubar 10 microlitros de solução de ácido fosfotúngstico a 1% para manchar a amostra durante três minutos. Remova o excesso de solução de ácido fosfotúngstico a 1% usando um lenço de laboratório e deixe-o secar ao ar por três minutos para obter imagens em um microscópio eletrônico de transmissão.As células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano pequenas vesículas extracelulares têm um modo de tamanho de partícula de 53 nanômetros, enquanto outros picos significativos de tamanho de partícula foram de 96 e 115 nanômetros. A concentração de pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano medida por NTA foi de 7,75 vezes 10 a 10 partículas por mililitro. A concentração de proteínas de pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano, medida com o ensaio de BCA, foi de aproximadamente 80 microgramas por mililitro.Na análise de western blotting, pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano demonstraram bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101, mas foram negativas para GRP94. As pequenas vesículas extracelulares derivadas do cordão umbilical humano foram visualizadas sob MET para determinar seu tamanho e morfologia. Células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano pequenas vesículas extracelulares de tamanho aproximado de 100 nanômetros e mostraram uma estrutura de membrana bicamada semelhante a uma taça.Com o desenvolvimento bem-sucedido do protocolo, podemos agora descobrir os potenciais terapêuticos de células-tronco mesenquimais derivadas de pequenas vesículas extracelulares em medicamentos regenerativos.

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

Volume pequenas (1-3L) Filtragem de Amostras de Água do Mar Coastal

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Biologia

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...