Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Публикация этого видео была поддержана My CytoHealth Sdn. Bhd.

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.
1. Мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека и культура
<ol><li>Культивируйте hUC-MSCs ...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

ЭВ являются одним из важных подмножеств секретома в МСК, которые играют решающую роль во время нормальных и патологических процессов. Тем не менее, в последнее десятилетие sEV с диапазоном размеров от 30 до 200 нм стали потенциальным инструментом для бесклеточной терапии. Были разработаны ...

Согласно MISEV 2018, sEV представляют собой нереплицирующиеся липидные бислойные частицы без функционального ядра размером 30-200нм 1. sEV, полученные из MSC, содержат важные сигнальные молекулы, которые играют важную роль в регенерации тканей, такие как микроРНК, цитокины или белки. Они все чаще становятся исследовательской «горячей точкой» в области регенеративной медицины и бесклеточной терапии. Многие исследования показали, что sEV, полученные из МСК, так же эффективны, как и МСК, при лечении различных состояний, таких как иммуномодуляция 2,3,4,5, усиление остеогенеза 6, сахарный диабет 7,8 или регенерация сосудов 9,10. По мере продвижения исследований на ранней стадии были выделены три основных ключевых вопроса, связанных с клинической трансляцией МСК-ЭВ: выход ВВ, чистота ВВ (свободные от клеточного мусора и других биологических загрязнителей, таких как белок и цитокины) и целостность фосфолипидной двухслойной мембраны ВВ после выделения.
Были разработаны различные методы выделения sEV с использованием плотности, формы, размера и поверхностного белка sEVs11. Двумя наиболее распространенными методами изоляции электромобилей являются методы на основе ультрацентрифугирования и ультрафильтрации.
Методы, основанные на ультрацентрифугировании, считаются золотым стандартом при выделении электромобилей. Два типа методов ультрацентрифугирования, которые обычно используются, - это дифференциальное ультрацентрифугирование и ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Однако методы ультрацентрифугирования часто приводят к низкому выходу и требуют дорогостоящего оборудования для высокоскоростной ультрацентрифуги (100 000-200 000 × г)11. Кроме того, методы ультрацентрифугирования сами по себе неэффективны при разделении подтипов EV (sEV и больших EV), что приводит к образованию нечистого слояосадка 11. Наконец, ультрацентрифугирование градиента плотности также может занимать много времени и требовать дополнительных мер предосторожности, таких как добавление буфера сахарозы, чтобы предотвратить повреждение градиента на этапах12 ускорения и замедления. Следовательно, ультрацентрифугирование обычно приводит к относительно низкому выходу и не способно различать различные популяции ЭВ13, что ограничивает его применение для крупномасштабной подготовкиЭВ 11.
Второй метод изоляции электромобилей - это ультрафильтрация, основанная на фильтрации по размеру. Ультрафильтрация относительно эффективна по времени и затратам по сравнению с ультрацентрифугированием, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования или длительного времени обработки14. Следовательно, ультрафильтрация, по-видимому, является более эффективным методом изоляции, чем оба вышеупомянутых метода ультрацентрифугирования. Изолированные продукты могут быть более конкретными в зависимости от размеров пор и более высокого выхода15. Однако дополнительная сила, возникающая в процессе фильтрации, может привести к деформации или извержению EV16.
В настоящем документе предложен экономичный и эффективный по времени настольный протокол для выделения sEV, полученных из MSC, для последующего анализа и терапевтических целей. Метод, описанный в этой статье, сочетал в себе простой метод фильтрации с настольным центрифугированием для выделения высокопродуктивных и качественных EV из hUC-MSC для последующего анализа, включая анализ размера частиц, анализ биомаркеров и электронно-микроскопическую визуализацию.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

Процесс, основанный на ультрацентрифугировании, считается распространенным методом выделения малых внеклеточных везикул (sEV). Однако выход от этого метода изоляции относительно ниже, и эти методы неэффективны при разделении подтипов sEV. Это исследование демонстрирует простой метод настольной фильтрации для выделения малых внеклеточных везикул МСК, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), успешно отделенных ультрафильтрацией от кондиционированной среды hUC-MSCs. Распределение по размерам, концентрация белка, экзосомальные маркеры (CD9, CD81, TSG101) и морфология выделенных hUC-MSC-sEV были охарактеризованы с помощью анализа отслеживания наночастиц, анализа белка BCA, вестерн-блоттинга и просвечивающего электронного микроскопа соответственно. Размер изолированных hUC-MSC-sEV составлял 30-200 нм, с концентрацией частиц 7,75 × 10 частиц /мл и концентрацией белка 80 мкг / мл. Наблюдались положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9, CD81 и TSG101. Это исследование показало, что hUC-MSC-sEV были успешно выделены из кондиционированной среды hUC-MSCs, а характеристика показала, что выделенный продукт соответствует критериям, указанным в Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул 2018 (MISEV 2018).

На рисунке 2 показано, что hUC-MSC-sEV имеют режим размера частиц на длине волны 53 нм, в то время как другие значимые пики размера частиц составляли 96 и 115 нм. Концентрация hUC-MSC-sEV, измеренная NTA, составляла 7,75 × 10 частиц /мл . Концентрация белка hUC-MSC-sEV, измеренная с помощью ан?...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Этот протокол демонстрирует, как изолировать небольшие внеклеточные везикулы мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), с помощью простой лабораторной настольной настройки. Распределение по размерам, концентрация белка, маркеры sEVs и морфология изолированных hUC-MSC-sEV характеризуются анализом отслеживания наночастиц, анализом белка BCA, вестерн-блоттингом и просвечивающим электронным микроскопом соответственно.

Простой метод настольной фильтрации для выделения небольших внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток человека

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Это простой и эффективный по времени протокол для выделения и концентрации небольших внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток. Этот метод легко использовать в большинстве лабораторий, поскольку это настольные весы, требующие только простых инструментов для операций. Чтобы выделить небольшие внеклеточные везикулы, мы рекомендуем выращивать клетки в больших масштабах, чтобы получить как минимум сто миллионов клеток.Хотя это звучит просто, некоторые важные шаги этой техники лучше информируются посредством визуальной демонстрации. Мы надеемся, что исследователи смогут извлечь уроки из нашего опыта и уверенно овладеть навыками. Наш аспирант, г-н Чан, Хонг Хао, расскажет вам о нашем опыте выделения и характеристики небольших внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток.Для начала центрифугируйте кондиционированную среду при 200 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Соберите и отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр размером 0,22 микрометра, чтобы удалить частицы размером более 220 нанометров. Заполнен центробежный фильтрующий блок 30 миллилитрами 0,2 микрометра фильтрованного фосфатно-буферного физиологического раствора.Затем центрифугируйте центробежный фильтрующий блок на 3 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Добавьте 70 миллилитров отфильтрованной кондиционированной среды в центробежный фильтрующий блок и центрифугируйте установку при 3 500 г при четырех градусах Цельсия.Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Добавьте 30 миллилитров фильтрованного фосфатно-буферного физиологического раствора и центрифугируйте устройство при 3 500 г при четырех градусах Цельсия. Установите чашку для сбора концентрата на фильтрующий блок и обратную центрифугу на 1 000 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить очищенные мелкие внеклеточные везикулы.Отфильтруйте мелкие внеклеточные везикулы через шприцевой фильтр размером 0,22 микрометра. Перенесите образцы в новые пробирки и храните их при температуре 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа. Чтобы начать анализ отслеживания наночастиц, разбавьте изолированные мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины человека, небольшие внеклеточные везикулы в фильтрованном фосфатно-буферном физиологическом растворе до 20-100 частиц в кадре.Введите один миллилитр разбавленного образца в анти-А-камеру с помощью одноразовых шприцев объемом один миллилитр. Установите соответствующие настройки измерения. Отрегулируйте уровень камеры до уровня 14.Для каждого измерения щелкните стандартное измерение и установите соответствующее разбавление. Затем нажмите «Захват», «Запустить камеру» и установите уровень камеры на 14, чтобы визуализировать небольшие электромобили. Чтобы начать измерение, нажмите кнопку «Создать», затем нажмите кнопку «Выполнить сценарий» и выберите расположение, в котором необходимо сохранить файлы.Введите необходимые сведения об образце и нажмите кнопку ОК. Щелкните параметр ОК, чтобы продолжить сценарий, и нажмите кнопку ОК, чтобы начать измерение. После того, как измерение было записано, проанализируйте результаты с порогом обнаружения пять, чтобы включить от 10 до 100 красных крестов на кадр. А количество синих крестов ограничено пятью.Нажмите кнопку Настройка ОК, чтобы продолжить сценарий и начать анализ. Нажмите кнопку ОК в уведомлении о завершении скрипта и экспорте, чтобы экспортировать данные в заданное место. Лизируйте мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины человека, небольшие внеклеточные везикулы с помощью ледяного радиоиммунопреципитации, анализа лизиса, буфера для лизиса и инкубируйте в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.Соберите надосадочную жидкость после центрифугирования при 200 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Количественно определите белок с помощью анализа BCA. Соберите набор для гель-электрофореза соответствующим образом и выполняйте гель-электрофорез при 90 вольтах, пока белок не достигнет конца геля для укладки.Измените напряжение на 200 вольт, чтобы отделить белки до конца рассасывающегося геля. Выполните полусухой перенос для переноса белков из геля в мембрану из поливинилидендифторида при напряжении 15 вольт в течение одного часа. Заблокируйте мембрану PVDF 3%-ным бычьим сывороточным альбумином в трис-буферном физиологическом растворе 0,1% Tween 20 в течение одного часа на шейкере при комнатной температуре.Инкубируйте мембрану PVDF с первичными антителами при четырех градусах Цельсия в течение ночи при постоянном встряхивании. На следующий день промойте мембрану PVDF пять раз и по пять минут TBST и далее инкубируйте со вторичным антителом в течение одного часа при перемешивании при комнатной температуре. Опять же, промойте мембрану PVDF TBST пять раз и визуализируйте мембрану в тепловизоре с зарядовой связью с помощью хемилюминесцентного реагента для обнаружения.Проанализируйте уровень экспрессии белков с помощью программного обеспечения ImageJ. Сначала откройте файл изображения в ImageJ. Улучшите качество изображения, отрегулировав яркость и контрастность.Корректируйте изображение до тех пор, пока кляксы не станут хорошо видны. Нажмите кнопку «Применить» и сохраните изображения в формате TIFF. Для анализа на основе просвечивающего электронного микроскопа разбавьте одну часть образца небольших внеклеточных везикул, полученных из мезенхимальных стволовых клеток пуповины, четырьмя частями отфильтрованного фосфатно-буферного физиологического раствора до общего объема 10 микролитров и инкубируйте на медной сетке с углеродным покрытием в течение 15 минут.Удалите излишки образца с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение трех минут. Инкубируйте 10 микролитров 1%-ного раствора фосфовольфрамовой кислоты, чтобы окрасить образец в течение трех минут. Удалите излишки 1%-ного раствора фосфовольфрамовой кислоты с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение трех минут для получения изображения под просвечивающим электронным микроскопом.Небольшие внеклеточные везикулы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека, имеют размер частиц 53 нанометра, в то время как другие значимые пики размера частиц составляли 96 и 115 нанометров. Концентрация малых внеклеточных везикул МСК, полученных из пуповины человека, измеренная с помощью NTA, составляла 7,75 от 10 до 10 частиц на миллилитр. Концентрация белка в малых внеклеточных везикулах МСК, полученных из пуповины человека, измеренная с помощью анализа BCA, составляла примерно 80 микрограммов на миллилитр.В анализе вестерн-блоттинга небольшие внеклеточные везикулы МСК, полученные из пуповины человека, продемонстрировали положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9, CD81 и TSG101, но были отрицательными для GRP94. Изолированные небольшие внеклеточные везикулы, полученные из пуповины человека, были визуализированы в рамках ПЭМ для определения их размера и морфологии. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины человека, небольшие внеклеточные везикулы размером около 100 нанометров и показали чашеобразную двухслойную мембранную структуру.Благодаря успешной разработке протокола мы теперь можем раскрыть терапевтический потенциал мезенхимальных стволовых клеток, полученных из небольших внеклеточных везикул, в регенеративных лекарствах.

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

Малого объема (1-3л) Фильтрация прибрежной морской воды Образцы

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Имплантация Ferumoxides Маркированный мезенхимальных стволовых клеток человека в Дефекты хряща

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Выделение и Культура Стоматологическая эпителиальных стволовых клеток из взрослых мышей резца

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Магнитные активированный ячейку Сортировка стратегии изоляции и очищают синовиальной жидкости производные мезенхимальных стволовых клеток из кролика модели

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

Высокий метод выхода для изоляции церебральных перицитов от мыши

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Масштабируемое выделение и очистка внеклеточных везикул от кишечной палочки и других бактерий

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...