Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

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NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Células madre mesenquimales del cordón umbilical humano y cultivo
<ol><li>Cultivar las hUC-MSCs a una densidad de siembra de 5 × 103/cm2 en DMEM, suplementado con 8% de lisado de plaquetas humanas y 1% de pen-estreptococo. Incubar las células a 37 °C enCO2 al 5%. Reemplace el medio d...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

Los EV son uno de los subconjuntos importantes del secretoma en las MSC que desempeñan un papel crucial durante los procesos normales y patológicos. Sin embargo, los sEV, con un rango de tamaño entre 30 y 200 nm, han aumentado como una herramienta potencial para la terapia libre de células en la última década. Se desarrollaron varias técnicas para aislar los sEV de las MSC. Sin embargo, la ultracentrifugación diferencial, la ultrafiltración, la precipitación basada en polímeros, la captura de inmunoafinidad y ...

Según MISEV 2018, los sEV son partículas de bicapa lipídica no replicantes sin núcleo funcional presente, con un tamaño de 30-200 nm1. Los sEV derivados de MSC contienen importantes moléculas de señalización que desempeñan un papel importante en la regeneración de tejidos, como microARN, citoquinas o proteínas. Se han convertido cada vez más en un "punto caliente" de investigación en medicina regenerativa y terapia libre de células. Muchos estudios han demostrado que los sEV derivados de MSC son tan efectivos como las MSC en el tratamiento de diferentes afecciones, como la inmunomodulación 2,3,4,5, la mejora de la osteogénesis 6, la diabetes mellitus7,8 o la regeneración vascular 9,10. A medida que avanzan los ensayos de fase temprana, se han destacado tres cuestiones clave principales en relación con la traducción clínica de las MSC-EV: el rendimiento de las EV, la pureza de las EV (libres de desechos celulares y otros contaminantes biológicos como proteínas y citoquinas) y la integridad de la membrana bicapa de fosfolípidos de las EV después del aislamiento.
Se han desarrollado varios métodos para aislar sEVs, explotando la densidad, forma, tamaño y proteína de superficie de los sEVs11. Los dos métodos más comunes en los aislamientos de sEV son las técnicas basadas en la ultracentrifugación y las basadas en la ultrafiltración.
Los métodos basados en la ultracentrifugación se consideran métodos estándar de oro en el aislamiento de sEV. Dos tipos de técnicas de ultracentrifugación que se emplean generalmente son la ultracentrifugación diferencial y la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Sin embargo, los métodos de ultracentrifugación a menudo resultan en un bajo rendimiento y requieren equipos costosos para la ultracentrífuga de alta velocidad (100,000-200,000 × g)11. Además, las técnicas de ultracentrifugación por sí solas son ineficientes para separar los subtipos de EV (sEV y EV grandes), lo que resulta en una capa de sedimento impuro11. Por último, la ultracentrifugación por gradiente de densidad también podría llevar mucho tiempo y requerir medidas de precaución adicionales, como la adición de tampón de sacarosa, para inhibir el daño del gradiente durante los pasos de aceleración y desaceleración12. Por lo tanto, la ultracentrifugación generalmente conduce a un rendimiento relativamente bajo y no es capaz de discriminar entre diferentes poblaciones de EV13, lo que limita su aplicación para la preparación de EV a gran escala11.
El segundo método de aislamiento EV es a través de ultrafiltración, que se basa en la filtración de tamaño. La ultrafiltración es relativamente rentable y rentable en comparación con la ultracentrifugación, ya que no implica equipos costosos ni largos tiempos de procesamiento14. Por lo tanto, la ultrafiltración parece ser una técnica de aislamiento más efectiva que los dos métodos de ultracentrifugación antes mencionados. Los productos aislados pueden ser más específicos en función del tamaño de los poros y el mayor rendimiento15. Sin embargo, la fuerza adicional incurrida durante el proceso de filtración puede resultar en la deformación o erupción de los EV16.
El documento actual propuso un protocolo de sobremesa rentable y rentable para aislar los sEV derivados de MSC para análisis posteriores y fines terapéuticos. El método descrito en este documento combinó un método de filtración simple con centrifugación de sobremesa para aislar EV de alto rendimiento y buena calidad de hUC-MSC para análisis aguas abajo, incluido el análisis de tamaño de partícula, ensayo de biomarcadores e imágenes microscópicas electrónicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

El proceso basado en la ultracentrifugación se considera el método común para el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares (sEV). Sin embargo, el rendimiento de este método de aislamiento es relativamente menor, y estos métodos son ineficientes para separar los subtipos de sEV. Este estudio demuestra un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas con éxito por ultrafiltración del medio condicionado de hUC-MSCs. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores exosomales (CD9, CD81, TSG101) y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizaron con análisis de seguimiento de nanopartículas, ensayo de proteína BCA, western blot y microscopio electrónico de transmisión, respectivamente. El tamaño de los hUC-MSC-sEVs aislados fue de 30-200 nm, con una concentración de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/ml y una concentración de proteínas de80 μg/mL. Se observaron bandas positivas para los marcadores exosomales CD9, CD81 y TSG101. Este estudio mostró que los hUC-MSC-sEV se aislaron con éxito del medio condicionado hUC-MSC, y la caracterización mostró que el producto aislado cumplía con los criterios mencionados por Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV 2018).

La Figura 2 muestra que los hUC-MSC-sEV tienen un modo de tamaño de partícula a 53 nm, mientras que otros picos significativos de tamaño de partícula fueron 96 y 115 nm. La concentración de hUC-MSC-sEVs medida por NTA fue de 7,75 × 1010 partículas/mL. La concentración proteica de hUC-MSC-sEVs medida con el ensayo BCA fue de aproximadamente 80 μg/ml.
En el análisis western blotting, los hUC-MSC-sEV demostraron bandas positivas para los marcador...

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A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Este protocolo demuestra cómo aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEV) con un entorno de laboratorio simple. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores de sEV y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizan por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el ensayo de proteínas BCA, el western blot y el microscopio electrónico de transmisión, respectivamente.

Un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales humanas

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Este es un protocolo simple y efectivo para aislar y concentrar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales. Esta técnica es fácil de adoptar en la mayoría de los laboratorios, ya que es una báscula de sobremesa y solo requiere instrumentos simples para las operaciones. Para aislar una de pequeñas vesículas extracelulares, recomendamos cultivar células a gran escala para obtener un mínimo de cien millones de células.Aunque suene simple, ciertos pasos críticos de esta técnica están mejor informados a través de la demostración visual. Esperamos que los investigadores puedan aprender de nuestra experiencia y dominar las habilidades con confianza. Nuestro estudiante de doctorado, el Sr. Chan, Hong Hao, lo guiará a través de nuestra experiencia en aislamiento y caracterizaciones de pequeñas vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales.Para comenzar, centrifugar el medio acondicionado a 200 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares. Recoja y filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar partículas mayores de 220 nanómetros. Llenó una unidad de filtro centrífugo con 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato filtrado de 0,2 micrómetros.Luego centrifugar la unidad de filtro centrífugo a 3, 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche la solución en el vaso de solución de filtrado. Agregue 70 mililitros de medio acondicionado filtrado en la unidad de filtro centrífugo y centrifugar la unidad a 3, 500 g a cuatro grados centígrados.Deseche la solución en el vaso de solución de filtrado. Agregue 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato filtrado y centrifugar la unidad a 3, 500 g a cuatro grados centígrados. Instale una taza de recolección de concentrado en la unidad de filtro y una centrífuga inversa a 1, 000 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados para obtener las pequeñas vesículas extracelulares purificadas.Filtre las pequeñas vesículas extracelulares a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Transfiera las muestras a nuevos tubos y guárdelas a 80 grados centígrados para su posterior análisis. Para comenzar el análisis de seguimiento de nanopartículas, diluya las pequeñas vesículas extracelulares aisladas de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano en solución salina tamponada con fosfato filtrado a 20 a 100 partículas por cuadro.Introducir un mililitro de la muestra diluida en la cámara anti-A utilizando jeringas desechables de un mililitro. Establezca los ajustes de medición en consecuencia. Ajuste el nivel de la cámara al nivel 14.Para cada medición, haga clic en la medición estándar y establezca la dilución en consecuencia. A continuación, haga clic en Capturar, Iniciar cámara y establezca el nivel de cámara en 14 para visualizar los EV pequeños. Para iniciar la medición, haga clic en Crear y, a continuación, haga clic en Ejecutar script y seleccione la ubicación donde se deben guardar los archivos.Introduzca los detalles necesarios de la muestra y haga clic en Aceptar. Haga clic en la configuración Aceptar para continuar con el script y haga clic en Aceptar para iniciar la medición. Una vez que se haya registrado la medición, analice los resultados con un umbral de detección de cinco para incluir de 10 a 100 cruces rojas por cuadro. Y el conteo de cruces azules se limita a cinco.Haga clic en Configuración correcta para continuar con el script e iniciar el análisis. Haga clic en Aceptar en la notificación de finalización del script y exporte para exportar los datos a la ubicación establecida. Lise las pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano con tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación helada e incube durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.Recoja el sobrenadante después de centrifugar a 200 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Cuantificar la proteína mediante un ensayo de BCA. Ensamble el conjunto de electroforesis en gel en consecuencia y realice la electroforesis en gel a 90 voltios hasta que la proteína alcance el extremo del gel de apilamiento.Cambie el voltaje a 200 voltios para separar las proteínas hasta el final del gel de resolución. Realice una transferencia semiseca para transferir las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno a 15 voltios durante una hora. Bloquear la membrana de PVDF con albúmina sérica bovina al 3% en solución salina tamponada con tris al 0,1% Tween 20 durante una hora en un agitador a temperatura ambiente.Incubar la membrana de PVDF con anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados durante la noche con agitación constante. Al día siguiente, lave la membrana de PVDF cinco veces y cinco minutos cada una con TBST e incube con un anticuerpo secundario durante una hora con agitación a temperatura ambiente. Una vez más, lave la membrana de PVDF con TBST cinco veces y visualice la membrana en un generador de imágenes de carga acoplada utilizando un reactivo de detección quimioluminiscente.Analizar el nivel de expresión de las proteínas utilizando el software ImageJ. Primero, abra el archivo de imagen en ImageJ. Mejore la calidad de la imagen ajustando el brillo y el contraste.Ajuste la imagen hasta que las manchas sean claramente visibles. Haga clic en el botón Aplicar y guarde las imágenes en formato TIFF. Para el análisis basado en microscopio electrónico de transmisión, diluir una parte de la muestra de pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano con cuatro partes de solución salina tamponada con fosfato filtrado hasta un volumen total de 10 microlitros e incubar en una rejilla de cobre recubierta de carbono durante 15 minutos.Retire el exceso de muestra con una toallita de laboratorio y deje que se seque al aire durante tres minutos. Incubar 10 microlitros de solución de ácido fosfotúngstico al 1% para teñir la muestra durante tres minutos. Retire el exceso de solución de ácido fosfotúngstico al 1% con una toallita de laboratorio y deje que se seque al aire durante tres minutos para obtener imágenes bajo un microscopio electrónico de transmisión.Las pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano tienen un modo de tamaño de partícula de 53 nanómetros, mientras que otros picos significativos de tamaño de partícula fueron de 96 y 115 nanómetros. La concentración de pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano medidas por NTA fue de 7,75 veces 10 a la décima partícula por mililitro. La concentración de proteínas de pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano medidas con el ensayo BCA fue de aproximadamente 80 microgramos por mililitro.En el análisis western blotting, las vesículas extracelulares pequeñas MSC derivadas del cordón umbilical humano demostraron bandas positivas para los marcadores exosomales CD9, CD81 y TSG101, pero fueron negativas para GRP94. Las pequeñas vesículas extracelulares MSC aisladas derivadas del cordón umbilical humano se visualizaron bajo TEM para determinar su tamaño y morfología. Células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano pequeñas vesículas extracelulares de aproximadamente 100 nanómetros y mostraron una estructura de membrana bicapa en forma de copa.Con el desarrollo exitoso del protocolo, ahora podemos descubrir los potenciales terapéuticos de las pequeñas vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales en medicinas regenerativas.

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

Volumen pequeño (1-3L) Filtración de muestras de agua marina costera

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Investigación

Biología

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Implantación de Ferumoxides Etiquetada células madre mesenquimales humanas en los defectos del cartílago

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

Un método de alta salida para aislar los pericytes cerebrales del ratón

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...