Name: a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Publiceringen av denna video stöddes av My CytoHealth Sdn. Bhd.

Se materialförteckningen för detaljer om alla material, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Mänskliga navelsträngsmesenkymala stamceller och odling
<ol><li>Odla hUC-MSC vid en sådddensitet på 5 × 103/cm2 i DMEM, kompletterat med 8% humant trombocytlysat och 1% Pen-Strep. Inkubera cellerna vid 37 °C i 5 %CO2. Byt ut cellodlingsmediet var 3: e dag för att säkerställa korrekt celltillväxt.</...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes.">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis.">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils.">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia.">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI.">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li><li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications.">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).</li><li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>K&#305;rba&#351;, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system.">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+exosomes,+naturally-equipped+nanocarriers,+for+drug+delivery.">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells.">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li></ol>

EV är en av de viktiga delmängderna av sekretomet i MSC som spelar en avgörande roll under normala och patologiska processer. Men sEV, med ett storleksintervall mellan 30 och 200 nm, har ökat som ett potentiellt verktyg för cellfri terapi under det senaste decenniet. Olika tekniker utvecklades för att isolera sEV från MSC. Differentiell ultracentrifugering, ultrafiltrering, polymerbaserad utfällning, immunoaffinitetsinfångning och mikrofluidikbaserad utfällning har emellertid olika fördelar och nackdelar<sup c...

Enligt MISEV 2018 är sEV icke-replikerande lipid-dubbelskiktspartiklar utan funktionell kärna närvarande, med en storlek på 30-200 nm1. MSC-härledda sEVs innehåller viktiga signalmolekyler som spelar viktiga roller i vävnadsregenerering, såsom mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har alltmer blivit en "hotspot" för forskning inom regenerativ medicin och cellfri terapi. Många studier har visat att MSC-härledda sEVs är lika effektiva som MSC vid behandling av olika tillstånd, såsom immunmodulering 2,3,4,5, förbättrad osteogenes6, diabetes mellitus 7,8 eller vaskulär regenerering 9,10. I takt med att prövningarna i tidig fas fortskrider har tre huvudfrågor i samband med den kliniska översättningen av MSC-EV lyfts fram: EV: s utbyte, EV: s renhet (fri från cellskräp och andra biologiska föroreningar som protein och cytokiner) och integriteten hos fosfolipid-dubbelskiktsmembranet i EV: erna efter isolering.
Olika metoder har utvecklats för att isolera sEV och utnyttja densiteten, formen, storleken och ytproteinet hos sEVs11. De två vanligaste metoderna vid sEV-isolering är ultracentrifugeringsbaserade och ultrafiltreringsbaserade tekniker.
Ultracentrifugeringsbaserade metoder betraktas som guldstandardmetoder i sEVs isolering. Två typer av ultracentrifugeringstekniker som vanligtvis används är differentiell ultracentrifugering och densitetsgradient ultracentrifugering. Ultracentrifugeringsmetoder resulterar emellertid ofta i lågt utbyte och kräver dyr utrustning för höghastighets ultracentrifug (100 000–200 000 × g)11. Dessutom är enbart ultracentrifugeringstekniker ineffektiva när det gäller att separera EV-subtyper (sEV och stora EV), vilket resulterar i ett orent sedimentskikt11. Slutligen kan ultracentrifugering av densitetsgradienter också vara tidskrävande och kräva ytterligare försiktighetssteg såsom tillsats av sackarosbuffert för att hämma gradientskadorna under accelerations- och retardationssteg12. Därför leder ultracentrifugering vanligtvis till ett relativt lågt utbyte och kan inte diskriminera mellan olika populationer av EV13, vilket begränsar dess tillämpning för storskalig EV-beredning11.
Den andra metoden för EV-isolering är via ultrafiltrering, som är baserad på storleksfiltrering. Ultrafiltrering är relativt tids- och kostnadseffektivt jämfört med ultracentrifugering, eftersom det inte innebär dyr utrustning eller långa bearbetningstider14. Därför verkar ultrafiltrering vara en effektivare isoleringsteknik än båda ovannämnda ultracentrifugeringsmetoder. De isolerade produkterna kan vara mer specifika baserat på porstorlekar och högre utbyte15. Den extra kraft som uppstår under filtreringsprocessen kan dock leda till deformation eller utbrott av EV16.
Det aktuella dokumentet föreslog ett kostnads- och tidseffektivt bänkprotokoll för att isolera MSC-härledda sEVs för nedströmsanalys och terapeutiska ändamål. Metoden som beskrivs i detta dokument kombinerade en enkel filtreringsmetod med bänkcentrifugering för att isolera EV med hög avkastning och god kvalitet från hUC-MSC för nedströmsanalys, inklusive partikelstorleksanalys, biomarköranalys och elektronmikroskopisk avbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06121-95</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14710-25</td>
			<td>Disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Methanol</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>45081</td>
			<td>To activate PVDF membrane (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>Chemiz</td>
			<td>14475</td>
			<td>catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD 81 (B-11)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-166029</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TSG 101 (C-2)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7964</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>00653-31</td>
			<td>PVDF membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>05808-61</td>
			<td>electrophoretic color marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC710008</td>
			<td>sEVs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiLumi One L</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>7880</td>
			<td>chemiluminescence detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor Freezing Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3124-100ML</td>
			<td>Cell cryopreserve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>08458-45</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker</td>
			<td>SMOBIO</td>
			<td>PM2610</td>
			<td>Protein molecular weight markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blotting paper</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>buffer reservior (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-2085-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgG&#954;BP-HRP)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-516102</td>
			<td>Secondary antibody (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Wharton&#8217;s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td>Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>&#160;sc-13118</td>
			<td>Antibody for sEVs marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 &#215; objective lens, a blue laser module (488&#8201;nm), and NTA software v3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>02890-45</td>
			<td>Sample Fixation during TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27327-81</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Washing, sample dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 
			0.45 mm pore size</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td>To hold protein during protein transfer (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>25955-11</td>
			<td>Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Bicinchoninate Kit</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06385-00</td>
			<td>Protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sample buffer solution with 2-ME</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30566-22</td>
			<td>Reducing agent for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15266-64</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31606-62</td>
			<td>ionic surfactant during gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope</td>
			<td>FEI, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td>chemicals to prepare gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-base</td>
			<td>1st Base</td>
			<td>BIO-1400-500g</td>
			<td>Chemicals for buffer (Western Blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tween 20</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30962</td>
			<td>Chemicals for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP (Ultra Vision Product) CCD imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCD imager for western blot signal detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple benchtop filtration method to isolate small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells

Den ultracentrifugeringsbaserade processen anses vara den vanliga metoden för isolering av små extracellulära vesiklar (sEV). Utbytet från denna isoleringsmetod är dock relativt lägre, och dessa metoder är ineffektiva för att separera sEV-subtyper. Denna studie demonstrerar en enkel bänkfiltreringsmetod för att isolera humana navelsträngshärledda MSC små extracellulära vesiklar (hUC-MSC-sEVs), framgångsrikt separerade genom ultrafiltrering från det konditionerade mediet av hUC-MSC. Storleksfördelningen, proteinkoncentrationen, exosomala markörer (CD9, CD81, TSG101) och morfologin hos de isolerade hUC-MSC-sEVs karakteriserades med nanopartikelspårningsanalys, BCA-proteinanalys, western blot respektive transmissionselektronmikroskop. De isolerade hUC-MSC-sEVs storlek var 30-200 nm, med en partikelkoncentration på 7,75 × 10 10 partiklar/ml och en proteinkoncentration på80 μg/ml. Positiva band för exosomala markörer CD9, CD81 och TSG101 observerades. Denna studie visade att hUC-MSC-sEVs framgångsrikt isolerades från hUC-MSCs konditionerade medium, och karakterisering visade att den isolerade produkten uppfyllde kriterierna som nämns i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Figur 2 visar att hUC-MSC-sEVs har ett partikelstorleksläge vid 53 nm, medan andra signifikanta toppar av partikelstorlek var 96 och 115 nm. Koncentrationen av hUC-MSC-sEVs uppmätt med NTA var 7,75 × 1010 partiklar/ml. Proteinkoncentrationen av hUC-MSC-sEVs uppmätt med BCA-analysen var cirka 80 μg/ml.
I western blotting-analys visade hUC-MSC-sEVs positiva band för exosomala markörer CD9, CD81 och TSG101, men var negativa för GRP94 (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Detta protokoll visar hur man isolerar humana navelsträngshärledda mesenkymala stamcellers små extracellulära vesiklar (hUC-MSC-sEVs) med en enkel bänkinställning i laboratorieskala. Storleksfördelningen, proteinkoncentrationen, sEV-markörerna och morfologin hos isolerade hUC-MSC-sEVs kännetecknas av nanopartikelspårningsanalys, BCA-proteinanalys, western blot respektive transmissionselektronmikroskop.

En enkel bänkfiltreringsmetod för att isolera små extracellulära vesiklar från humana mesenkymala stamceller

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Detta är ett enkelt och tidseffektivt protokoll för att isolera och koncentrera små extracellulära vesiklar från mesenkymala stamceller. Denna teknik är lätt att anta i de flesta laboratorier eftersom det är en bänkskala och endast kräver enkla instrument för operationer. För att isolera en av små extracellulära vesiklar rekommenderar vi att odla celler i stor skala för att få minst hundra miljoner celler.Även om det låter enkelt, informeras vissa kritiska steg i denna teknik bättre genom visuell demonstration. Vi hoppas att forskare kan lära av vår erfarenhet och behärska färdigheterna med tillförsikt. Vår doktorand, Mr.Chan, Hong Hao, kommer att guida dig genom vår erfarenhet av isolering och karakteriseringar av små extracellulära vesiklar från mesenkymala stamceller.För att börja, centrifugera det konditionerade mediet vid 200 g i fem minuter vid fyra grader Celsius för att avlägsna cellskräp. Samla och filtrera supernatanten genom ett 0,22 mikrometerfilter för att avlägsna partiklar större än 220 nanometer. Fyllde en centrifugalfilterenhet med 30 ml 0,2 mikrometer filtrerad fosfatbuffrad saltlösning.Centrifugera sedan centrifugalfilterenheten vid 3 500 g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera lösningen i filtratets lösningskopp. Tillsätt 70 ml filtrerat konditionerat medium i centrifugalfilterenheten och centrifugera enheten vid 3 500 g vid fyra grader Celsius.Kassera lösningen i filtratets lösningskopp. Tillsätt 30 ml filtrerad fosfatbuffrad saltlösning och centrifugera enheten vid 3 500 g vid fyra grader Celsius. Installera en koncentratuppsamlingskopp på filterenheten och omvänd centrifug vid 1 000 g i två minuter vid fyra grader Celsius för att erhålla de renade små extracellulära vesiklarna.Filtrera de små extracellulära vesiklarna genom ett 0,22 mikrometer sprutfilter. Överför proverna till nya rör och förvara dem vid 80 grader Celsius för vidare analys. För att påbörja nanopartikelspårningsanalys, späd de isolerade humana navelsträngshärledda mesenkymala stamcellerna små extracellulära vesiklar i filtrerad fosfatbuffrad saltlösning till 20 till 100 partiklar per ram.För in en milliliter av det utspädda provet i anti-A-kammaren med en milliliter engångssprutor. Ställ in mätinställningarna därefter. Justera kameranivån till nivå 14.För varje mätning klickar du på standardmätningen och ställer in utspädningen därefter. Klicka sedan på Capture, Start Camera och ställ in Camera Level till 14 för att visualisera de små elbilarna. Starta mätningen genom att klicka på Skapa, sedan på Kör skript och välja den plats där filerna ska sparas.Skriv in nödvändig information om exemplet och klicka på OK. Klicka på inställningen OK för att fortsätta skriptet och klicka på OK för att starta mätningen. När mätningen har registrerats, analysera resultaten med en detektionströskel på fem för att inkludera 10 till 100 röda kors per ram. Och det blå korset är begränsat till fem.Klicka på Ange OK för att fortsätta skriptet och initiera analysen. Klicka på OK i meddelandet om slutförd skript och export för att exportera data till den angivna platsen. Lysera de mesenkymala stamcellerna från människa navelsträngshärledda, små extracellulära vesiklar med iskall radioimmunoprecipitationsanalys, lyseringsbuffert och inkubera i 30 minuter vid fyra grader Celsius.Samla upp supernatanten efter centrifugering vid 200 g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kvantifiera proteinet med hjälp av en BCA-analys. Montera gelelektroforesuppsättningen i enlighet därmed och utför gelelektrofores vid 90 volt tills proteinet når staplingsgelens ände.Ändra spänningen till 200 volt för att separera proteinerna tills slutet av lösningsgelen. Utför halvtorr överföring för att överföra proteinerna från gelén till ett polyvinylidendifluoridmembran vid 15 volt i en timme. Blockera PVDF-membranet med 3% bovint serumalbumin i trisbuffrad saltlösning 0,1% Tween 20 i en timme på en shaker vid rumstemperatur.Inkubera PVDF-membranet med primära antikroppar vid fyra grader Celsius över natten med konstant skakning. Nästa dag, tvätta PVDF-membranet fem gånger och fem minuter vardera med TBST och inkubera ytterligare med en sekundär antikropp i en timme med omrörning vid rumstemperatur. Tvätta PVDF-membranet med TBST fem gånger och visualisera membranet i en laddningskopplad avbildning med hjälp av ett kemiluminescerande detektionsreagens.Analysera uttrycksnivån för proteinerna med hjälp av ImageJ-programvaran. Öppna först bildfilen i ImageJ. Förbättra bildens kvalitet genom att justera ljusstyrkan och kontrasten.Justera bilden tills fläckarna är tydligt synliga. Klicka på knappen Apply och spara bilderna i TIFF-format. För transmissionselektronmikroskopbaserad analys, späd en del av det humana navelsträngshärledda mesenkymala stamcellsprovet små extracellulära vesiklar med fyra delar filtrerad fosfatbuffrad saltlösning till en total volym av 10 mikroliter och inkubera på ett kolbelagt kopparnät i 15 minuter.Ta bort överflödigt prov med en laboratorieduk och låt det lufttorka i tre minuter. Inkubera 10 mikroliter 1% fosfotungstisk syralösning för att färga provet i tre minuter. Ta bort överskottet av 1% fosfotungstisk syralösning med en laboratorieduk och låt den lufttorka i tre minuter för att avbilda under ett transmissionselektronmikroskop.Mänskliga navelsträngshärledda mesenkymala stamceller små extracellulära vesiklar har ett partikelstorleksläge på 53 nanometer, medan andra signifikanta toppar av partikelstorlek var 96 och 115 nanometer. Koncentrationen av MSC små extracellulära vesiklar från människa som navelsträngshärletts uppmätt med NTA var 7,75 gånger 10 till 10:e partiklarna per milliliter. Proteinkoncentrationen hos MSC små extracellulära vesiklar från människa som navelsträngshärletts med BCA-analysen var cirka 80 mikrogram per milliliter.I western blotting-analys visade MSC små extracellulära vesiklar från human navelsträng positiva band för exosomala markörer CD9, CD81 och TSG101, men var negativa för GRP94. De isolerade humana navelsträngshärledda MSC små extracellulära vesiklarna visualiserades under TEM för att bestämma deras storlek och morfologi. Mänskliga navelsträngshärledda mesenkymala stamceller, små extracellulära vesiklar som var cirka 100 nanometer och visade en koppliknande dubbelskiktsmembranstruktur.Med den framgångsrika utvecklingen av protokollet kan vi nu avslöja den terapeutiska potentialen hos mesenkymala stamceller härledda små extracellulära vesiklar i regenerativa läkemedel.

Research

JoVE Journal

Biology

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

Liten mängd (1-3L) Filtrering av Coastal Havsvatten Prover

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Implantation av Ferumoxides Märkta mänskliga mesenkymala stamceller i brosk fel

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyror: En enkel och snabb DNA-extraktion metod

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktiverad Cell sortering strategier för att isolera och rena Synovial vätska-Derived mesenkymala stamceller från en kanin-modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

En hög utgångs metod för att isolera cerebral pericyter från mus

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från Escherichia coli och andra bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...