Name: positron emission tomography imaging of cell trafficking: a method of cell radiolabeling
Uploaded: 2023-10-27T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 und DOE DE-SC0008947 Grants, Internationale Atomenergie-Organisation, Wien, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Abteilung für Radiologie, und Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.

Dendritische Zellen und Melanomzellen wurden kommerziell gewonnen18. Hepatozyten wurden nach laparoskopischer partieller Hepatektomie aus der Leber von Schweinen isoliert22,24. Die Stammzellen wurden aus Knochenmarkaspiraten isoliert18,19,26. Die aus dem Fettgewebe gewonnenen Stammzellen wurden aus dem Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clini...

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	<li>Bhawnani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+stem+cell+therapies+in+improving+clinical+outcomes+in+patients+with+heart+failure.">Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure.</a> Cureus. 13 (8), e17236 (2021).</li><li>Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+past,+present,+and+future.">Stem cells: past, present, and future.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 68 (2019).</li><li>Bukhari, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+mechanisms+in+adult+stem+cell+signaling+and+therapy.">Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy.</a> Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).</li><li>D'Aloia, M. M., Zizzari, I. 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M., Shakeri-Zadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+tracking+of+tumor+vaccination+and+antigen+presentation+by+dendritic+cells.">In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).</li><li>Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. 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V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+nuclear-based+imaging+in+gene+and+cell+therapy:+probe+considerations.">Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).</li><li>Fogli, L. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+tracking+of+dendritic+cells+in+melanoma+patients+for+monitoring+of+cellular+therapy.">Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy.</a> Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).</li><li>Gosmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promise+and+challenges+of+clinical+non-invasive+T-cell+tracking+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy.</a> EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).</li></ol>

Im Folgenden sind wichtige Schritte im Protokoll aufgeführt, die für eine effektive Radiomarkierung von Zellen optimiert werden müssen. In den Protokollschritten 1.2 und 1.3 muss je nach verwendetem Volumen von [89 Zr]Zr(HPO4)2 oder [89Zr]ZrCl4 ein geeignetes Volumen (Mikroliter) Base verwendet werden; 1,0 MK2CO3-Lösung muss für die Neutralisation von [89 Zr]Zr(HPO4)2 und 1,0 M Na2CO3-Lösung für die Neutralisation von [</s...

Stammzell- und chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien gewinnen an Popularität und werden aktiv für die Behandlung verschiedener Krankheiten wie Myokardversagen1,2, Netzhautdegeneration 2, Makuladegeneration 2, Diabetes 2, Myokardinfarkt 3,4,5 und Krebs 6,7,8,9 untersucht.10. Unter den beiden plausiblen Ansätzen von Stammzelltherapien können Stammzellen entweder direkt auf die Krankheitsstelle transplantiert werden, um eine therapeutische Reaktion hervorzurufen, oder Veränderungen in der Mikroumgebung der Krankheitsstelle verursachen, ohne an der Krankheitsstelle zu haften, um eine indirekte therapeutische Reaktion auszulösen. Ein indirektes therapeutisches Ansprechen könnte Veränderungen in der Mikroumgebung des Krankheitsortes verursachen, indem Faktoren freigesetzt werden, die die Krankheit reparieren oder behandeln würden5. Diese Ansätze von Stammzelltherapien konnten durch nicht-invasive Bildgebung von radioaktiv markierten Stammzellen evaluiert werden. Die nicht-invasive Bildgebung könnte die Aufnahme der radioaktiv markierten Zellen an der Krankheitsstelle mit einem therapeutischen Ansprechen korrelieren, um das direkte und indirekte therapeutische Ansprechen zu entschlüsseln.
Darüber hinaus werden immunzellbasierte Therapien entwickelt, um verschiedene Krebsarten mit CAR-T-Zellen 6,7,8,9,10 und dendritischen Zellimmuntherapien 11,12 zu behandeln. Mechanistisch werden T-Zellen in der CAR-T-Zell-Immuntherapie 6,7,8,9,10 so verändert, dass sie ein Epitop exprimieren, das an ein spezifisches Antigen auf Tumoren bindet, das behandelt werden muss. Diese gentechnisch veränderten CAR-T-Zellen binden nach der Verabreichung durch eine Epitop-Antigen-Interaktion an das spezifische Antigen, das auf den Tumorzellen vorhanden ist. Nach der Bindung werden die gebundenen CAR-T-Zellen aktiviert, vermehren sich dann und setzen Zytokine frei, die dem Immunsystem des Wirts signalisieren, den Tumor anzugreifen, der das spezifische Antigen exprimiert. Im Gegensatz dazu werden dendritische Zellen im Falle von dendritischen Zelltherapien11,12 so verändert, dass sie ein spezifisches Krebsantigen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Diese manipulierten dendritischen Zellen besiedeln bei der Verabreichung die Lymphknoten und binden an die T-Zellen in den Lymphknoten. Die T-Zellen durchlaufen nach der Bindung an die spezifischen Krebsantigene auf den verabreichten dendritischen Zellen eine Aktivierung/Proliferation und initiieren eine Immunantwort des Wirts gegen den Tumor, der dieses spezifische Antigen exprimiert. Daher ist die Beurteilung des Transports von verabreichten CAR-T-Zellen zu einer Tumorstelle9,10 und des Homings von dendritischen Zellen zu den Lymphknoten11,12 durch die Bildgebung von radioaktiv markierten CAR-T-Zellen und dendritischen Zellen möglich, um die Wirksamkeit der Immuntherapie zu bestimmen. Darüber hinaus kann der nicht-invasive Zelltransport dazu beitragen, das therapeutische Potenzial besser zu verstehen, das direkte und indirekte therapeutische Ansprechen zu klären und das therapeutische Ansprechen sowohl von Stammzell- als auch von Immunzell-basierten Therapien vorherzusagen und zu überwachen.
Es wurden verschiedene bildgebende Modalitäten für den Zelltransport untersucht 3,4,9,10,12, darunter optische Bildgebung, Magnetresonanztomographie (MRT), Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT) und Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Jede dieser Techniken hat ihre eigenen Vor- und Nachteile. Unter diesen ist PET aufgrund ihrer quantitativen Natur und hohen Sensitivität, die für die zuverlässige Quantifizierung von Zellen im bildgebenden Zelltransport unerlässlich sind, die vielversprechendste Modalität 3,4,9,10.
Das Positronen-emittierende Radioisotop 89Zr mit einer Halbwertszeit von 78,4 h eignet sich für die Zellmarkierung. Es ermöglicht die PET-Bildgebung des Zelltransports über 1 Woche lang und wird von weit verbreiteten, energiearmen medizinischen Zyklotronen 13,14,15,16,17 leicht hergestellt. Darüber hinaus ist ein entsprechend funktionalisierter, p-Isothiocyanatobenzyl-Desferrioxamin (DFO-Bn-NCS)-Chelator für die Synthese eines 89 Zr-markierten, gebrauchsfertigen, zellmarkierenden Synthons, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin, auch bekannt als [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24, kommerziell erhältlich,25. Das Prinzip der [89 Zr]Zr-DBN-vermittelten Zellmarkierung basiert auf einer Reaktion zwischen primären Aminen von Zellmembranproteinen und dem Isothiocyanat (NCS)-Teil von [89Zr]Zr-DBN, um eine stabile kovalente Thioharnstoffbindung zu erzeugen.
[89Zr] Zr-DBN-basierte Zellmarkierung und Bildgebung wurden veröffentlicht, um eine Vielzahl verschiedener Zellen zu verfolgen, darunter Stammzellen 18,23,25, dendritische Zellen18, kardiopoetische Stammzellen19, deziduale Stromazellen 20, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen 20, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes 20, Jurkat/CAR-T-Zellen 21, Hepatozyten 22,24 und weiße Blutkörperchen 25. Das folgende Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Methoden zur Präparation und Radiomarkierung von Zellen mit [89Zr]Zr-DBN und beschreibt Änderungen, die im Radiomarkierungsprotokoll für einen bestimmten Zelltyp erforderlich sein können. Zur besseren Übersichtlichkeit ist die hier vorgestellte Methode der radioaktiven Zellmarkierung in vier Abschnitte unterteilt. Der erste Abschnitt befasst sich mit der Herstellung von [89 Zr]Zr-DBN durch Chelatbildung von 89Zr mit DFO-Bn-NCS. Der zweite Abschnitt beschreibt die Herstellung einer biokompatiblen Formulierung von [89Zr]Zr-DBN, die leicht für die radioaktive Markierung von Zellen verwendet werden kann. Der dritte Abschnitt behandelt die Schritte, die für die Vorkonditionierung von Zellen für die radioaktive Markierung erforderlich sind. Die Vorkonditionierung der Zellen beinhaltet das Waschen der Zellen mit proteinfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und HEPES-gepufferter Hanks-Salzlösung (H-HBSS), um externe Proteine zu entfernen, die die Reaktion von [89Zr]Zr-DBN mit primären Aminen, die während der radioaktiven Markierung auf den Proteinen der Zelloberfläche vorhanden sind, stören oder mit ihr konkurrieren könnten. Der letzte Abschnitt beschreibt die Schritte der eigentlichen radioaktiven Markierung der Zellen und der Analyse der Qualitätskontrolle.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>12571063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange column</td>
			<td>Macherey-Nagel, Inc., D&#252;ren, Germany</td>
			<td>731876</td>
			<td>Chromafix 30-PS-HCO3&#160;SPE 45 mg cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning Inc., Glendale, AZ, USA</td>
			<td>352096</td>
			<td>Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cells</td>
			<td>The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CRL-11904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFO-Bn-NCS</td>
			<td>Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA</td>
			<td>B-705</td>
			<td>p-SCN-Bn-Deferoxamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dose calibrator</td>
			<td>Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA</td>
			<td>5130-3234</td>
			<td>CRC -55tR Dose Calibrator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;</td>
			<td>The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>14025092</td>
			<td>For preparation of H-HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>A508P212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melanoma cells</td>
			<td>The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30108442</td>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA</td>
			<td>415-ML-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td>For washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Covidien LLC, Mansfield, MA, USA</td>
			<td>1020</td>
			<td>0.9% Sterile Saline Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317</td>
			<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel-rad-TLC paper sheet&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>iTLC-SG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

positron emission tomography imaging of cell trafficking: a method of cell radiolabeling

Stammzell- und chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien entwickeln sich zu vielversprechenden Therapeutika für die Organregeneration und als Immuntherapie für verschiedene Krebsarten. Trotz erheblicher Fortschritte in diesen Bereichen gibt es noch mehr zu lernen, um die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik der verabreichten therapeutischen Zellen im lebenden System besser zu verstehen. Für die nicht-invasive, in vivo Verfolgung von Zellen mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurde eine neuartige [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89 Zr]Zr-DBN)-vermittelte Zellradiomarkierungsmethode unter Verwendung von 89Zr (t1/2 78,4 h) entwickelt. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein [89Zr]Zr-DBN-vermitteltes, gebrauchsfertiges, radioaktiv markierendes Synthon für die direkte radioaktive Markierung einer Vielzahl von Zellen, einschließlich mesenchymaler Stammzellen, liniengesteuerter kardiopoetischer Stammzellen, leberregenerierender Hepatozyten, weißer Blutkörperchen, Melanomzellen und dendritischen Zellen. Die entwickelte Methodik ermöglicht eine nicht-invasive PET-Bildgebung des Zelltransports für bis zu 7 Tage nach der Verabreichung, ohne die Beschaffenheit oder Funktion der radioaktiv markierten Zellen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine schrittweise Methode für die Radiosynthese von [89 Zr]Zr-DBN, die biokompatible Formulierung von [89 Zr]Zr-DBN, die Vorbereitung von Zellen für die radioaktive Markierung und schließlich die radioaktive Markierung von Zellen mit [89Zr]Zr-DBN, einschließlich aller komplizierten Details, die für die erfolgreiche radioaktive Markierung von Zellen erforderlich sind.

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Manuskript vorgestellt werden, wurden aus den vorangegangenen [89Zr]Zr-DBN-Synthese- und Zellradiomarkierungsstudienzusammengestellt 18,19,22,23,24,25. Kurz gesagt, 89Zr können erfolgreich mit DFO-Bn-NCS in ~30-60 min bei 25-37 °C unter Verwendung von 7,5-...

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Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Hier wird ein Protokoll zur radioaktiven Markierung von Zellen mit einem Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Radioisotop, 89 Zr (t1/2 78,4 h), unter Verwendung eines gebrauchsfertigen radioaktiv markierenden Synthons, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89Zr]Zr-DBN), vorgestellt. Die radioaktive Markierung von Zellen mit [89Zr]Zr-DBN ermöglicht die nicht-invasive Verfolgung und Bildgebung von radioaktiv markierten Zellen im Körper mit PET für bis zu 7 Tage nach der Verabreichung.

Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung des Zelltransports: Eine Methode der radioaktiven Markierung von Zellen

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

Dieses Protokoll beschreibt eine schrittweise Methode zur radioaktiven Markierung von Zellen und Zirkonium-89-DBN und deren nicht-invasives Tracking mittels PET. Diese Technik bietet auch eine zuverlässige und stabile Methode zur radioaktiven Markierung von Zellen durch eine kovalente Konjugation von Zirkonium-89-DBN mit den primären Mitteln der Zelloberflächenproteine. Für Ärzte und Wissenschaftler, die mit Zelltherapien für neurologische Erkrankungen und verschiedene Krebsarten arbeiten, ist dieses Protokoll für das Verständnis der Pharmakokinetik zellbasierter Therapien durch nicht-invasive PET-Bildgebung von entscheidender Bedeutung.Das detaillierte Protokoll bietet neuen Benutzern eine Anleitung zum Erlernen und Anwenden dieser radioaktiven Markierungstechnik. Zusätzliche Knoten, die bei den kritischen Schritten enthalten sind, helfen bei der Problembehandlung für einen neuen Benutzer. Bereiten Sie zunächst eine Säule mit etwa 100 Milligramm Hydroxamatharz vor und aktivieren Sie sie, indem Sie die Säule mit acht Millilitern reinem wasserfreiem Acetonitril waschen, gefolgt von einer Spülung mit fünf bis sechs Millilitern Luft.Zwei Milliliter 0,5 normale Salzsäure in die Säule geben. Nach einer zusätzlichen Spülung von fünf bis sechs Millilitern Luft wird die Lösung, die sowohl Zirkonium-89 als auch natürliches Yttrium enthält, langsam in das Hydroxamatharz gegeben. Waschen Sie das ungebundene natürliche Yttrium aus dem Hydroxamatharz mit 20 Millilitern zweier normaler Salzsäure, gefolgt von 10 Millilitern entionisiertem Wasser.Um Zirkonium in Form von Zirkonium-89-Hydrogenphosphat zu vermeiden, geben Sie 0,5 Milliliter 1,2 molaren Dikaliumphosphat-Kaliumdihydrogenphosphatpuffer in die Säule und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf der Säule sitzen. Fügen Sie zusätzlich 1,5 Milliliter 1,2 molaren Puffer hinzu, um das Zirkonium aus der Säule zu eluieren. Als nächstes nehmen Sie etwa 120 Mikroliter Zirkonium-89-Hydrogenphosphat, das im Puffer formuliert ist, und neutralisieren Sie die Lösung mit HEPES-KOH und Kaliumcarbonat, um einen pH-Wert von 7,528 zu erreichen.Vier Mikroliter frisch zubereitetes fünfmillimolares DFO-Bn-NCS werden zu rund 285 Mikrolitern neutralisiertem Zirkonium-89-Hydrogenphosphat gegeben. Und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren. Nach der Isolierung von Zirkonium aus Yttrium werden 0,5 Milliliter eines molaren Oxalsäures in die Säule gegeben und eine Minute lang auf der Säule gelassen, um Zirkonium in Form von Zirkonium-89-Oxalat zu eluieren.Geben Sie weitere 2,5 Milliliter einer molaren Oxalsäure in die Säule. Um Zirkonium-89-Oxalat in Zirkonium-89-Chlorid umzuwandeln, waschen Sie die Anionenaustauschsäule mit sechs Millilitern Acetonitril und spülen Sie anschließend fünf bis sechs Milliliter Luft. Waschen Sie dann die Säule mit 10 Milliliter Kochsalzlösung, gefolgt von einem weiteren Luftstoß.Laden Sie die zirkonium-89-oxalathaltige Lösung langsam auf die aktivierte Anionenaustauschsäule, bevor Sie sie erneut mit Luft waschen. Waschen Sie dann die Säule mit 50 Millilitern deionisiertem Wasser, um das ungebundene Oxalat-Ion zu entfernen. Um Zirkonium in Form von Zirkonium-89-Chlorid zu vermeiden, geben Sie 0,1 Milliliter einer normalen Salzsäure in die Säule und lassen Sie sie eine Minute lang auf der Säule sitzen.Das Zirkonium wird mit zusätzlichen 0,4 Millilitern einer normalen Salzsäure aus der Säule eluiert. Trocknen Sie das ausgetretene Zirkonium-89-Chlorid in einem V-förmigen Fläschchen, indem Sie es 10 bis 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius unter einem stetigen Stickstoffgasstrom in einen Heizblock legen, und stellen Sie dann das getrocknete Zirkonium-89-Chlorid in Wasser wieder her. Bereiten Sie 500 Mikroliter Zellsuspension mit ca. 6 Millionen Zellen in 500 Mikrolitern HEPES-gepuffertem HBSS in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und fügen Sie etwa 100 Mikroliter des formulierten Zirkonium-89-DBN hinzu.Mischen Sie das Zirkonium-89-DBN und die Zellsuspension, indem Sie die Lösung vorsichtig mit einer Mikropipette auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen und das Zirkonium-89-DBN-Gemisch auf einem Schüttler bei etwa 550 U/min bei 25 bis 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten für die Zellmarkierung. Führen Sie eine radioaktive TLC für die radioaktive Markierungsreaktion der Zelle mit einem frisch hergestellten radioaktiven DC-Lösungsmittel durch.Berechnen Sie den Prozentsatz der Radioaktivität bei Rf gleich 0,01 bis 0,02 anhand der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung. Mischen Sie in einem separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen etwa 100 Mikroliter des formulierten Zirkonium-89-DBN mit etwa 500 Mikrolitern HEPES-gepuffertem HBSS, um es als No-Cell-Kontrolle für die Hintergrundkorrektur zu verwenden. Berechnen Sie den Prozentsatz der Radioaktivität bei Rf gleich 0,01 bis 0,02 mit der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung, und berechnen Sie dann die effektive radioaktive Markierung der Zelle, indem Sie die beiden berechneten Radioaktivitätsprozentsätze subtrahieren.Nachdem Sie den Abschluss der radioaktiven Markierung bestätigt haben, fügen Sie 600 Mikroliter gekühltes, für die Zelle geeignetes vollständiges Medium hinzu, um die radioaktive Markierungsreaktion zu löschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 96 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Und wirf den Überstand weg.Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen vorsichtig in 500 Mikroliter des gekühlten Mediums, indem Sie das Medium mit einer Mikropipette auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 96 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand. Berechnen Sie als Nächstes die endgültige radioaktive Markierungseffizienz nach allen Wäschen anhand der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung.Um die Qualität der radioaktiv markierten Zellen sicherzustellen, wird die endgültige Suspension der radioaktiv markierten Zellen visuell inspiziert, und wenn keine Klumpen vorhanden sind, wird innerhalb einer Stunde nach der radioaktiven Markierung und den Waschschritten ein Trypanblau-Ausschluss-Viabilitätstest mit einer 0,4%igen Trypanblaulösung durchgeführt, die in PBS hergestellt wurde. Die Chelatbildungseffizienz von DFO-Bn-NCS für Zirkonium-89 unter Verwendung von Zirkonium-89-Hydrogenphosphat und Zirkonium-89-Chlorid ist unterschiedlich, gemessen durch radioaktive DC. Hier wird die Stabilität verschiedener mit Zirkonium-89 radioaktiv markierter Zellen über sieben Tage gezeigt.Die Retention von Zirkonium-89-Radioaktivität durch radioaktiv markierte Zellen erwies sich in allen untersuchten Zellen als stabil, wobei ein vernachlässigbarer Ausfluss über sieben Tage nach der Markierung beobachtet wurde. Die Effizienz der radioaktiven Markierung von Zellen in verschiedenen Zelltypen mit Zirkonium-89-DBN ist in dieser Tabelle dargestellt. Die radioaktive Markierungseffizienz der Zelle variiert zwischen 20 und 50 %, da nach dem Waschen eine unkorrigierte Ausbeute im radioaktiv markierten Zellpellet beobachtet wird.Der kritischste Schritt dieses Protokolls ist die Zugabe von DFO-Bn-NCS zum Chelat-Gemisch und die Qualitätsbewertung der radioaktiv markierten Zellen. Die Anwendung dieser Technik wird dazu beitragen, die Pharmakokinetik zellbasierter Therapien zu verstehen. Es würde auch die Frage aufwerfen, ob es klinisch notwendig ist, das Clearance-Profil von Zelltherapien zu verändern.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Forschung

Krebsforschung

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-Darstellung der Brust Epithelzelle Migration nach der vorübergehenden Erschöpfung der TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management von Atembewegungsartefakten in 18F-Fluorodeoxyglucose Positronen-Emissionstomographie mit einem Amplituden-basierten optimalen Respiratory Gating-Algorithmus

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...