يوفر التصنيع عالي الإنتاجية لكتل بناء microgel أحادية التشتت لسقالات الجسيمات الملدنة المسامية الدقيقة تحكما معززا في مسامية السقالة. هذا يمكن أن يؤثر على حجم المسام ونتائج تكامل الأنسجة اللاحقة. يستخدم هذا البروتوكول نهج الموائع الدقيقة عالي الإنتاجية لتوليد كميات كبيرة من المواد الهلامية الدقيقة أحادية التشتت التي لا يمكن تحقيقها بطرق أخرى مثل الموائع الدقيقة التي تركز على التدفق ، ومستحلب الدفعات ، والرش الكهربائي.
يمكن تشكيل المواد الهلامية الدقيقة المتولدة في سقالات جسيمات صلبة مسامية دقيقة مفيدة لتطبيقات الطب التجديدي بسبب مسامية نطاق الخلية التي تسمح بالأنسجة السريعة والنمو. ابدأ بإعداد شريحة زجاجية واحدة لكل جهاز PDMS microfluidic. استخدم الشريط أو الهواء المصفى أو غسولات كحول الأيزوبروبيل لإزالة أي غبار من الشريحة.
ضع شريحة زجاجية في شريحة تصميم جهاز PDMS لأعلى بجانب بعضها البعض على غطاء لوحة 96 بئرا وضعها في منظف البلازما. أغلق الباب وصمام تدفق الهواء وقم بتشغيل مضخة التفريغ. اتركه يعمل لمدة 30 ثانية على الأقل، ثم أوقف تشغيله.
قم بتوصيل أنبوب غاز خزان الأكسجين بصمام تدفق الهواء. دع غرفة البلازما تملأ بالأكسجين لمدة 30 ثانية ، ثم أوقف تشغيل الأكسجين وأغلق صمام تدفق الهواء. قم بتشغيل مضخة التفريغ واضبط مستوى تردد الراديو على عالي.
انتظر حتى تتحول الغرفة إلى لون وردي بنفسجي واسمح بمرور 30 ثانية. عندما ينطفئ المؤقت ، قم بإيقاف تشغيل البلازما والفراغ ، ثم افتح صمام تدفق الهواء ببطء لتحرير الفراغ. قم بإزالة الدرج من منظف البلازما.
اقلب جهاز PDMS برفق على الشريحة الزجاجية لربطه. عندما يحدث الترابط ، لاحظ الاختلاف الطفيف في شفافية PDMS. للحصول على أفضل النتائج، قم بتخزين الأجهزة المستعبدة عند 60 درجة مئوية حتى قبل الاستخدام مباشرة.
تحضير المعالجة السطحية عن طريق تخفيف PFOCTS وزيت Novec واستخدام ملليلتر واحد لثلاثة إلى أربعة أجهزة. انقل الحجم إلى حقنة ملليلتر واحدة وأرفق إبرة قياس 25. قطع قطعة من 10 إلى 12 سم من أنابيب Tygon لكل جهاز.
قطع قطعة من أنابيب PEEK حوالي بوصة واحدة في الطول. أدخل بضعة ملليمترات من أنبوب PEEK في نهاية أنبوب Tygon لمنع الإبرة من ثقب مداخل أنابيب Tygon. أخرج الأجهزة من الغرفة المدفأة وأدخل الطرف غير PEEK لأنبوب Tygon في فتحة المدخل المائي.
أدخل إبرة حقنة المعالجة السطحية في أنبوب PEEK وقم بتغطية فتحة مخرج غرفة الزيت. حقن العلاج ببطء والتأكد من أنه يملأ الجهاز دون فقاعات. انتظر حتى تملأ الغرف المائية أولا ، تليها القنوات الأصغر ثم غرفة الزيت.
قم بإزالة أنبوب Tygon من الجهاز. بمجرد ملء الجهاز ، اتركه يرتاح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. املأ حقنة سعة خمسة ملليلتر بالزيت فقط وأرفق إبرة قياس 25.
قم بشفط المعالجة السطحية من الجهاز من خلال المداخل والمخرجات. أدخل أنابيب Tygon في المدخل المائي. أدخل المحقنة بالزيت في أنبوب PEEK واغسل كل جهاز بالزيت.
شفط الزيت من الجهاز. كرر تدفق الزيت مرتين وقم بإزالة أنبوب Tygon. أدخل الطرف غير PEEK لأنبوب Tygon في مداخل أجهزة الموائع الدقيقة.
أدخل القطعة المتبقية من أنابيب Tygon بدون أنابيب PEEK في النهاية في منفذ جهاز الموائع الدقيقة. أضف ما لا يقل عن ثلاثة ملليلترات من الزيت إلى حقنة بلاستيكية سعة خمسة ملليلتر وقم بإرفاقها بإبرة قياس 25. أدخل الإبرة بعناية في أنبوب PEEK على أحد مداخل Tygon.
اغسل الأنابيب والجهاز بالزيت برفق. جمع الزيت من المخرج في أنبوب مخروطي. كرر تدفق الزيت على مدخل Tygon الآخر.
اضبط مضخات المحاقن على معدلات التدفق المطلوبة. قم بتوصيل المحقنة التي تحتوي على الفاعل بالسطح بمدخل الزيت عبر إبرة قياس 25 وقم بتوزيع ما يكفي من الزيت بلطف لتشغيل الأنابيب وقناة الزيت الخاصة بجهاز الموائع الدقيقة. بمجرد إعداد الجهاز ومداخل الزيت ، أضف 0.5 ملليلتر من الزيت إلى حقنة جديدة من خمسة ملليلتر تحتوي على سلائف الجل.
استخدم هذه الكمية الصغيرة من الزيت للمساعدة في طرد محلول السلائف من خلال جهاز الموائع الدقيقة. في أنبوب مخروطي ، اجمع 1.5 ملليلتر من محلول العمود الفقري PEG و 1.5 ملليلتر من محلول الوصلة المتقاطعة. دوامة لمدة 30 ثانية ونقل بسرعة حل السلائف هلام مجتمعة إلى حقنة خمسة ملليلتر.
قم بتوصيل المحقنة بمحلول السلائف الهلامية إلى المدخل المائي عبر إبرة قياس 25. قم بتوزيع محلول كاف بلطف لتشغيل الأنابيب والقناة المائية. قم بتثبيت المحاقن على مضخات المحقنة واضغط على تشغيلها.
ابحث عن جزيئات ذات حجم موحد من القنوات. جمع microgels من مخرج في أنبوب مخروطي. بمجرد اكتمال التبلور ، استخدم ماصة لإزالة مرحلة الزيت بعناية من أسفل الأنبوب.
قم بإيداع هذا في حاوية نفايات مناسبة للنفايات المفلورة. أضف المزيد من الزيت إلى أنبوب جمع الميكروجيل. اخلطي عن طريق قلب أنبوب التجميع برفق.
دع أنبوب التجميع يستقر لمدة خمس دقائق للسماح للمراحل بالفصل. ابحث عن مرحلة الزيت في الأسفل ومرحلة ميكروجيل مائي في الأعلى. كرر غسل الزيت مرتين على الأقل.
أضف المزيد من الزيت مع الجل كما هو موضح سابقا ، ثم أضف PBS إلى الجل. عكس للخلط عدة مرات. لفصل الطبقات ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 2،000 RCF لمدة 30 ثانية تقريبا.
ابحث عن مرحلة الزيت في الجزء السفلي من الأنبوب ، والجل في الوسط و PBS في الأعلى. قم بإزالة مرحلة الزيت باستخدام ماصة وتخلص منها في حاوية نفايات. كرر الزيت ويغسل PBS مرتين.
ابحث عن الجل للانتقال من غير شفاف إلى شفاف بواسطة الغسيل النهائي. إزالة كل النفط. لا تقم بإزالة PBS من الأنبوب المخروطي.
في غطاء الدخان الكيميائي ، استخدم ماصة زجاجية لإضافة الهكسانات إلى الأنبوب بحجم مساو ل PBS. دوامة الأنبوب المخروطي لمدة 30 ثانية أو حتى يتم خلطه جيدا. جهاز طرد مركزي في 4 ، 696 RCF لمدة خمس دقائق.
بعد الانفصال ، ابحث عن الهكسانات في الطبقة العليا ، PBS في الوسط والجل في الأسفل. قم بإزالة طبقة الهكسان وتخلص منها في حاوية للنفايات العضوية. شفط PBS.
كرر الهكسان في PBS يغسل مرتين على الأقل أو حتى يبدو الجل شفافا تقريبا. اغسل الجل باستخدام PBS مرة أخرى لإزالة أي بقايا هيكسان متبقية. جهاز طرد مركزي في 4،696 RCF لمدة خمس دقائق وشفط طبقة PBS.
تم تعديل حوالي 67-75 ٪ من 20 كيلودالتون PEG maleimide مع مجموعات وظيفية ميثاكريلاميد لضمان كفاءة تلدين عالية. تم تحديد النسبة المئوية للتعديل من خلال تحليل قمم أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1H. قدمت بداية الهلام نظرة ثاقبة على مدة توليد microfluidic microgelic.
يوصى باختيار درجة الحموضة السلائف الهلامية التي يمكن أن تبدأ الهلام بين 30 دقيقة وساعتين. بعد التنقية والتورم ، كان للهلاميات الدقيقة حجم موحد ومؤشر تعدد التشتت بين 1.00 و 1.02 تم تعريفها على أنها مجموعة أحادية التشتت. بعد التلدين ، شكلت الهلاميات الدقيقة سقالة مسامية تم تصورها باستخدام مجهر ثنائي الفوتون.
يعد ربط جهاز PDMS بشكل صحيح بالشريحة الزجاجية ومعالجة سطح الجهاز بشكل صحيح أمرا بالغ الأهمية للحصول على أفضل أداء لجهاز الموائع الدقيقة. تسمح هذه التقنية بالإنتاج السريع لكتل بناء microgel موحدة لتشكيل سقالات الخرائط التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات التجديدية في الجسم الحي بما في ذلك التئام الجروح.
