微多孔性アニール粒子足場用の単分散ミクロゲルビルディングブロックのハイスループット製造は、足場の多孔性の制御を強化します。これは、細孔サイズとその後の組織統合の結果に影響を与える可能性があります。このプロトコルは、ハイスループットマイクロ流体アプローチを使用して、フローフォーカシングマイクロフルイディクス、バッチエマルジョン、エレクトロスプレーなどの他の方法では達成できない大量の単分散ミクロゲルを生成します。
生成されたミクロゲルは、迅速な組織と成長を可能にする細胞スケールの多孔性により、再生医療用途に有利な微多孔性アニール粒子足場に形成することができます。まず、PDMSマイクロ流体デバイスごとに1枚のスライドガラスを準備します。テープ、ろ過された空気、またはイソプロピルアルコール洗浄を使用して、スライドからほこりを取り除きます。
PDMSデバイスのデザインスライドにスライドガラスを96ウェルプレートの蓋の上に並べて置き、プラズマクリーナーに入れます。ドアとエアフローバルブを閉じ、真空ポンプをオンにします。少なくとも30秒間実行してから、オフにします。
酸素タンクガスチューブをエアフローバルブに接続します。プラズマチャンバーを30秒間酸素で満たしてから、酸素をオフにして気流バルブを閉じます。真空ポンプをオンにし、無線周波数レベルを高に設定します。
チャンバーが紫色に変わるまで待ち、30秒が経過します。タイマーが鳴ったら、プラズマと真空をオフにしてから、エアフローバルブをゆっくりと開いて真空を解放します。プラズマクリーナーからトレイを取り外します。
PDMSデバイスをスライドガラスにそっと裏返して接着します。ボンディングが発生すると、PDMSの透明度のわずかな違いが観察されます。最良の結果を得るには、ボンディングされたデバイスを使用する直前まで摂氏60度で保管してください。
PFOCTSとNovecオイルを希釈して表面処理を準備し、3〜4台のデバイスに1ミリリットルを使用します。容量を1ミリリットルのシリンジに移し、25ゲージの針を取り付けます。デバイスごとに10〜12センチメートルのタイゴンチューブを切り取ります。
長さ約1インチのPEEKチューブを切り取ります。数ミリメートルのPEEKチューブをタイゴンチューブの端に挿入して、針がタイゴンチューブの入口に穴を開けないようにします。加熱チャンバーからデバイスを取り出し、タイゴンチューブの非PEEK端を水性入口穴に挿入します。
表面処理シリンジの針をPEEKチューブに挿入し、オイルチャンバーの出口穴を覆います。トリートメントをゆっくりと注入し、気泡なしでデバイスを満たすことを確認します。最初に水性チャンバーが充填され、次に小さなチャネル、次にオイルチャンバーが充填されるのを待ちます。
デバイスからタイゴンチューブを取り外します。デバイスがいっぱいになったら、室温で10分間休ませます。5ミリリットルの注射器にオイルのみを入れ、25ゲージの針を取り付けます。
入口と出口からデバイスから表面処理を吸引します。タイゴンチューブを水性入口に挿入します。オイルを入れたシリンジをPEEKチューブに挿入し、各デバイスをオイルで洗い流します。
デバイスからオイルを吸引します。オイルフラッシュを2回繰り返し、タイゴンチューブを取り外します。タイゴンチューブの非PEEK端をマイクロ流体デバイスの入口に挿入します。
端にPEEKチューブがないタイゴンチューブの残りの部分をマイクロ流体デバイスの出口に挿入します。5ミリリットルのプラスチックシリンジに少なくとも3ミリリットルのオイルを加え、25ゲージの針に取り付けます。タイゴンインレットの1つにあるPEEKチューブに針を慎重に挿入します。
チューブとデバイスをオイルで静かに洗い流します。円錐形のチューブの出口からオイルを集めます。もう一方のタイゴンインレットでオイルフラッシュを繰り返します。
シリンジポンプを希望の流量に設定します。界面活性剤を含むシリンジを25ゲージの針を介してオイルインレットに接続し、マイクロ流体デバイスのチューブとオイルチャネルをプライミングするのに十分なオイルを静かに分配します。デバイスとオイルインレットをセットアップしたら、ゲル前駆体を含む新しい5ミリリットルのシリンジに0.5ミリリットルのオイルを追加します。
この少量のオイルを使用して、マイクロ流体デバイスを通して前駆体溶液を洗い流すのに役立ちます。円錐管に、1.5ミリリットルのPEG骨格溶液と1.5ミリリットルの架橋剤溶液を混ぜ合わせます。30秒間ボルテックスし、組み合わせたゲル前駆体溶液を5ミリリットルのシリンジに素早く移します。
ゲル前駆体溶液を含むシリンジを25ゲージの針を介して水性入口に接続します。チューブと水性チャネルをプライミングするのに十分な溶液を静かに分配します。シリンジをシリンジポンプにクランプし、実行を押します。
チャネルから均一なサイズの粒子を探します。ミクロゲルをコニカルチューブの出口から集める。ゲル化が完了したら、ピペットを使用してチューブの底から油相を慎重に取り除きます。
これをフッ素化廃棄物用の適切な廃棄物容器に入れます。マイクロゲル収集チューブにオイルを追加します。収集チューブを静かに反転させて混合します。
収集チューブを5分間沈降させて、相を分離させます。下部の油相と上部の水性ミクロゲル相を探します。オイル洗浄を少なくとも2回以上繰り返します。
前に示したように、ゲルにオイルを追加してから、PBSをゲルに追加します。反転して数回混ぜます。層を分離するには、チューブを2, 000 RCFで約30秒間遠心分離します。
チューブの下部にある油相、中央にゲル、上部にPBSを探します。ピペットで油相を取り除き、廃棄物容器に捨てます。オイルとPBS洗浄を2回繰り返します。
最終洗浄までに不透明から透明に移行するゲルを探します。すべてのオイルを取り除きます。円錐管からPBSを取り外さないでください。
化学ヒュームフードで、ガラスピペットを使用して、PBSに等しい容量でヘキサンをチューブに追加します。円錐管を30秒間、または完全に混合するまで渦巻きます。4, 696 RCFで5分間遠心分離します。
分離後、最上層にヘキサン、中央にPBS、最下層にゲルを探します。ヘキサン層を取り除き、有機廃棄物用の容器に捨てます。PBSを吸引します。
PBS洗浄でヘキサンを少なくとも2回、またはゲルがほぼ半透明になるまで繰り返します。ゲルをもう一度PBSで洗浄して、残っているヘキサン残留物を取り除きます。4, 696 RCFで5分間遠心分離し、PBS層を吸引します。
20キロダルトンのPEGマレイミドの約67〜75%がメタクリルアミド官能基で修飾され、高いアニーリング効率を確保した。修飾率は、1H NMRスペクトルピークを分析することによって決定した。ゲル化の開始は、マイクロ流体ミクロゲル生成の持続時間に関する洞察を提供しました。
30分から2時間の間にゲル化を開始できるゲル前駆体pHを選択することをお勧めします。精製および膨潤後、ミクロゲルは、単分散集団として定義される1.00〜1.02の間の均一なサイズおよび多分散指数を有した。アニーリング後、ミクロゲルは、2光子顕微鏡で可視化された多孔質足場を形成した。
PDMSデバイスをスライドガラスに正しく接着し、デバイスを正しく表面処理することは、マイクロ流体デバイスに最適な性能を発揮するために重要です。この技術により、均一なミクロゲルビルディングブロックを迅速に製造してマップ足場を形成し、創傷治癒を含むさまざまなin vivo再生アプリケーションに使用できます。
