Name: construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall at JoVE.com

Forfatterne anerkender, at dette arbejde blev støttet af tilskud fra Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20ZR1411700), National Natural Science Foundation of China (81771971) og Shanghai Sailing Program (22YF1406600).

Humane aortaprøver blev brugt til primær HASMC-isolering under godkendelse af Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortaprøver blev indsamlet fra patienter, der gennemgik stigende aorta-kirurgi på Zhongshan Hospital, Fudan University. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter før deltagelse.
1. Primær human aorta glat muskelcelleisolering
<ol><li>Vask den højre laterale region af den stigende aorta med steri...

<ol>
	<li>Olsson, C., Thelin, S., St&#229;hle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection:+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14,000+cases+from+1987+to+2002.">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li><li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+remodeling:+lessons+from+genetic+diseases.">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li><li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro.">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP/TAZ+signaling+pathway.">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li><li>Fabre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+a+manuscript+series+on+the+characterization+and+use+of+microphysiological+systems+(MPS)+in+pharmaceutical+safety+and+ADME+applications.">Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications.</a> Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).</li><li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans?+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection.">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li><li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro.">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li><li>Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+liver+models+on+a+microplatform:+well-defined+culture,+engineering+of+liver+tissue+and+liver-on-a-chip.">3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip.</a> Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-on-a-chip+based+on+stem+cell+biology.">Heart-on-a-chip based on stem cell biology.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).</li><li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity.">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).</li><li>Perestrelo, A. R., &#193;guas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ/body-on-a-chip+devices+at+the+convergence+of+biology+and+microengineering.">Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cancer-on-a-chip+for+drug+screening.">Construction of cancer-on-a-chip for drug screening.</a> Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+organ-on-a-chip+to+improve+cell+capture+efficiency.">Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency.</a> International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).</li><li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting.">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).</li><li>Mohammed, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+devices:+improvement+of+surface+quality+of+CO2+laser+machined+poly+(methylmethacrylate)+polymer.">Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).</li><li>Tsao, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+microfluidics:+Simple,+low-cost+fabrication+process+bridging+academic+lab+research+to+commercialized+production.">Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production.</a> Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).</li><li>Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+electrochemiluminescence+(ECL)+in+and+for+microfluidic+analytical+devices.">A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).</li><li>Stefanadis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-diameter+relation+of+the+human+aorta.+A+new+method+of+determination+by+the+application+of+a+special+ultrasonic+dimension+catheter.">Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter.</a> Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).</li><li>Williams, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+vascular+smooth+muscle+cell+function.">Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function.</a> Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).</li><li>Abudupataer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta+smooth+muscle-on-a-chip+reveals+impaired+mitochondrial+dynamics+as+a+therapeutic+target+for+aortic+aneurysm+in+bicuspid+aortic+valve+disease.">Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease.</a> eLife. 10, 69310 (2021).</li><li>Poussin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+human+microvessel-on-a-chip+model+for+studying+monocyte-to-endothelium+adhesion+under+flow+-+application+in+systems+toxicology.">3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology.</a> Altex. 1, 47-63 (2020).</li><li>Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artery-on-a-chip+platform+for+automated,+multimodal+assessment+of+cerebral+blood+vessel+structure+and+function.">Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function.</a> Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).</li></ol>

Med den hurtige udvikling af mikrofluidisk teknologi er OOC-modeller, der kan replikere den biologiske funktion og struktur af et eller flere organer in vitro, opstået i de senere år til applikationer inden for biologi, medicin og farmakologi15. OOC kan simulere nøglefunktioner i det menneskelige fysiologiske mikromiljø, der er afgørende for at udforske sygdomsmekanismer og fremme præklinisk lægemiddeloversættelse 8,16. Se...

Thorax aortaaneurisme og dissektion (TAAD) er en lokaliseret dilatation eller delaminering af aortavæggen, der er forbundet med høj sygelighed og dødelighed1. Humane aorta glatte muskelceller (HASMC'er) spiller en afgørende rolle i patogenesen af TAAD. HASMC'er er ikke terminalt differentierede celler, og HASMC'er bevarer høj plasticitet, så de kan skifte fænotyper som reaktion på forskellige stimuli2. HASMC'er udsættes hovedsageligt for rytmisk trækbelastning in vivo, og dette er en af nøglefaktorerne, der regulerer glatte muskelmorfologiske ændringer, differentiering og fysiologiske funktioner 3,4. Derfor kan cyklisk belastnings rolle i undersøgelsen af HASMC'er ikke ignoreres. Imidlertid kan konventionelle 2D-cellekulturer ikke replikere den biomekaniske stimulering af cyklisk stamme, som HASMC'er oplever in vivo. Derudover er konstruktionen af en TAAD-model til dyr ikke egnet til nogle typer TAAD, såsom bicuspid aortaklap (BAV) -relateret TAAD. Desuden kan artskløften mellem kliniske humane undersøgelser og dyreforsøg ikke ignoreres. Det hindrer farmaceutisk oversættelse i klinisk praksis. Der er således et presserende behov for mere komplekse og fysiologiske systemer til at simulere det in vivo biomekaniske miljø i forskningen af aortasygdomme.
Dyreforsøg, der anvendes i biomedicinsk forskning og lægemiddeludvikling, er dyre, tidskrævende og etisk tvivlsomme. Desuden kan resultaterne fra dyreforsøg ofte ikke forudsige de resultater, der er opnået i kliniske forsøg på mennesker 5,6. Manglen på humane prækliniske modeller og høj fejlrate i kliniske forsøg har resulteret i få effektive lægemidler til klinikken, hvilket har øget sundhedsomkostningerne7. Det haster derfor med at finde andre eksperimentelle modeller til at supplere dyremodeller. Mikrofabrikation og mikrofluidiske teknikker har udviklet sig meget i de senere år og giver nye teknikker til etablering af organoider-on-a-chip-modeller, der afhjælper ulemperne ved traditionelle 2D-cellekulturteknikker og etablerer en mere realistisk, billig og effektiv in vitro-model til fysiologiske undersøgelser og lægemiddeludvikling. Ved hjælp af mikrofluidiske enheder etableres organer-på-chips til dyrkning af levende celler i kamre på størrelse med mikrometer med forskellige stimuli for at replikere nøglefunktionerne i et væv eller organ. Systemet består af enkelte eller flere mikrofluidiske mikrokanaler, hvor enten en slags celle dyrkes i et perfunderet kammer, der replikerer funktioner af en vævstype eller forskellige celletyper dyrket på porøse membraner for at genskabe grænseflader mellem forskellige væv. Mikrofluidbaserede organoider kombineret med patientafledte celler har den unikke fordel at bygge bro over den store artsforskel mellem muse- og humane sygdomsmodeller og overvinde ulemperne ved traditionel 2D-cellekultur til sygdomsmekanismeforskning og lægemiddelopdagelse. Med den hurtige udvikling af mikrofluidik i de sidste par år har forskere indset nytten af in vitro organ-on-a-chip (OOC) modeller, der replikerer komplekse in vivo biologiske parametre8. Disse mikrofluidiske organoider simulerer in vitro biomekaniske miljøer, såsom cyklisk belastning, forskydningsspænding og væsketryk, hvilket giver et tredimensionelt (3D) cellekulturmiljø. Til dato er flere OOC-modeller blevet etableret for at simulere biomekaniske stimuli i organer som lunge9, nyre 10, lever11, tarm 12 og hjerte 13, men disse er ikke blevet anvendt bredt til undersøgelse af human aortasygdom.
I denne undersøgelse præsenterer vi en human aorta glat muskelcelleorgan-on-a-chip (HASMC-OOC) model, der kan kontrollere de biomimetiske mekaniske kræfter og rytmer, der anvendes på TAAD-patientafledte primære HASMC'er. Chippen består af trelags tykke plader af polydimethylsiloxan (PDMS) ætset med kanaler og to kommercialiserede meget fleksible PDMS-membraner. HASMC'er dyrkes på PDMS-membranerne. Kanalen i midten af chippen er fyldt med et kulturmedium til cellekultur. Chippens øverste og nederste kanaler er forbundet til et vakuumtrykforsyningssystem, der kan styre rytmen og frekvensen af mekanisk trækbelastning af PDMS-membranerne. Rytmisk stamme, der opleves af HASMC'er, kan simuleres i HASMC-OOC og replikere det biomekaniske mikromiljø af væv eller organ, der ikke er funktionelt opnåeligt med konventionelle 2D-kultursystemer. Med fordelen ved højopløsning, realtidsbilleddannelse og biomekanisk mikromiljø kan levende cellers biokemiske, genetiske og metaboliske aktiviteter studeres for vævsudvikling, organfysiologi, sygdomsætiologi, molekylære mekanismer og biomarkøridentifikation, hjerte-kar-sygdomme og aortasygdom. Kombineret med vævsspecifikke og patientceller kan dette system bruges til lægemiddelscreening, personlig medicin og toksicitetstest. Denne HASMC-OOC-model giver en ny in vitro-platform til undersøgelse af patogenesen af aortasygdommen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td>Used for cell immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0408</td>
			<td>Antibodies used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST025-20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium AM/PI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Ab46794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flexible 
			PDMS membrane</td>
			<td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td>
			<td>KYQ-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoses</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>96410</td>
			<td>1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human aortic smooth 
			muscle cell line CRL1999</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Lot Number:70019189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Imagej.net/fiji/downloads</td>
			<td>Free Download: https://fiji.sc</td>
			<td>Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ensures that the temperature, 
			humidity, and light exposure is 
			exactly the same throughout 
			experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>RH-M016</td>
			<td>Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse collagen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma&#160;</td>
			<td>Changzhou Hongming Instrument</td>
			<td>HM-Plasma5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>30-0138A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0221A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458-100ml</td>
			<td>Antibiodics used to prevent bacterial 
			contamination of cells during culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>F01A-STP-B046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC controller</td>
			<td>Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory</td>
			<td>BR010-11T8X2M</td>
			<td>The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMCM</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>Cat 1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>VQZ300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST795</td>
			<td>To penetrate cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filter</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>ZFC5-6</td>
			<td>Official website address: https://www.smc.com.cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>KVP15-KL-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum regulator</td>
			<td>AirTAC</td>
			<td>GVR-200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Name</td>
			<td>Forward (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td>Reverse (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td>
			<td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td>
			<td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall

Konventionelle todimensionelle cellekulturteknikker og dyremodeller er blevet anvendt i undersøgelsen af human thoraxaortaaneurisme og dissektion (TAAD). Imidlertid kan menneskelig TAAD undertiden ikke karakteriseres af dyremodeller. Der er en tilsyneladende artskløft mellem kliniske humane undersøgelser og dyreforsøg, der kan hindre opdagelsen af terapeutiske lægemidler. I modsætning hertil er den konventionelle cellekulturmodel ikke i stand til at simulere in vivo biomekaniske stimuli. Til dette formål har mikrofabrikation og mikrofluidiske teknikker udviklet sig meget i de senere år, hvilket giver nye teknikker til etablering af organoider-on-a-chip-modeller, der replikerer det biomekaniske mikromiljø. I denne undersøgelse blev der udviklet en human aorta glat muskelcelleorgan-på-en-chip (HASMC-OOC) model til at simulere de patofysiologiske parametre for aorta biomekanik, herunder amplituden og hyppigheden af cyklisk stamme oplevet af humane aorta glatte muskelceller (HASMC'er), der spiller en afgørende rolle i TAAD. I denne model blev HASMC'ernes morfologi langstrakt i form, justeret vinkelret på belastningsretningen og præsenterede en mere kontraktil fænotype under belastningsforhold end under statiske konventionelle forhold. Dette var i overensstemmelse med celleorienteringen og fænotypen i indfødte menneskelige aortavægge. Derudover etablerede vi BAV-TAAD- og TAV-TAAD-sygdomsmodeller ved hjælp af bicuspid aortaklap-relaterede TAAD (BAV-TAAD) og tricuspid aortaklaprelaterede TAAD (TAV-TAAD) patientafledte primære HASMC'er. HASMC-OOC-modellen giver en ny in vitro-platform , der supplerer dyremodeller til yderligere udforskning af patogenesen af TAAD og opdagelse af terapeutiske mål.

HASMC-OOC-modellen består af et vakuumstyringssystem, et cirkulationssystem og PDMS-chips og det skematiske design af HASMC-OOC-modellen (figur 1). Vakuumstyringssystemet består af en vakuumpumpe, magnetventiler og en PLC-regulator. For at fungere som cirkulationssystem blev en peristaltisk pumpe brugt til at opdatere cellekulturmediet og tilføje lægemidler. PDMS-chippen bestod af to vakuumkamre og et mellemkammer fyldt med SMCM til cellevækst. I henhold til designet af spånstrukturen ...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall at JoVE.com

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Her udviklede vi en human aorta glat muskelcelleorgan-på-en-chip-model til at replikere den in vivo biomekaniske stamme af glatte muskelceller i den menneskelige aortavæg.

Konstruktion af en human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip-model til rekapitulering af biomekanisk belastning i aortavæggen

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Denne model stimulerer biomekaniske stimuli, der opleves af glatte muskelceller i human aorta. Kombineret med patientafledte celler kan dette system bruges til lægemiddelscreening og personlig medicin af aortasygdomme. Denne model kan efterligne og præcist kontrollere de nøgne mekaniske parametre for de glatte muskelceller i human aorta, hvilket giver en ny in vitro-platform til undersøgelse og patogenese af aortasygdomme.Mieradilijiang Abudubat, en plakatlæge fra vores laboratorium, demonstrerer proceduren. Begynd med at vaske den højre laterale region af den stigende aorta med sterile pbs, en eller to gange. Fjern intima og en adventitia lag af vævet med to oftalmiske tang og behold medielaget for at høste cellerne.Placer medielaget på en 10 centimeter skål og skær den i to til tre millimeter stykker. Derefter tilsættes fem milliliter SMCM indeholdende 10% fbs og 1% penicillin streptomycin til vævsprøverne. Flyt det lille væv ind i kulturflasken med en steril dråber, og spred vævet jævnt.Kassér kulturmediet så meget som muligt. Vend derefter flasken på hovedet. Tilsæt to milliliter SMCM i den omvendte kulturflaske og læg den i inkubatoren med 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius i en til to timer.Drej den derefter langsomt med højre side opad og tilsæt yderligere to milliliter SMCM. Efter fem til syv dages inkubation udveksles SMCM med fire ml frisk SMCM. Kassér langsomt og tilføj SMCM, når du skifter medie.Generelt klatrer sporadiske glatte muskelceller ud om cirka to uger. Transporter kulturflasken forsigtigt, når du flytter til en mikroskopstation. Ellers vil vævene flyde, og cellerne vil vokse langsomt.Når cellerne er vokset, opdeles de i to nye kulturflasker med fire milliliter frisk SMCM. Identificer cellerne gennem en immunfluorescensanalyse af fire specifikke markører for glatte muskelceller. For at polymerisere PDMS tilsættes hærdningsmidlet eller B-komponenten til basen eller A-komponenten og blandes komplekset i fem minutter.Volumenet afhænger af undersøgelsens behov. Anbring den tilberedte PDMS-gel i en vakuumudsugningstank i 30 til 60 minutter, og hold trykket under negative 0,8 milli pascal. Brug computerstøttet designsoftware til at designe formen.Specialfremstiller formene i de tre lag ved hjælp af en højpræcisionscomputer numerisk kontrolgraveringsmaskine. Efter udskæring af rammen af formene og mikrokanalerne ved hjælp af PMMA-plader, lim dem på en anden plade. Hæld den tilberedte PDMS-gel på en designet form.Derefter krydsbindes ved 70 grader Celsius i en til to timer. Skræl de tværbundne PDMS-plader af formen og skær de kommercialiserede PDMS-membraner i sektioner på 100 millimeter gange 40 millimeter. Stans huller på de tre PDM'er plader ved hjælp af en en millimeter hul puncher til at gøre indløb og udløb af luft og mellemstore mikrokanaler på PDMS chip.Behandl de tre forberedte PDMS-plader og to PDMS-membraner med iltplasma i fem minutter til PDMs overfladeaktivering. Indstil rumluften til at behandle gas, trykket til negative 100 kilopascal , strøm til 180 til 200 milliamp moler, spænding til 200 volt og behandlingstiden til fem minutter. Bond tre PDMS-plader og to PDMS-membraner sammen under et stereoskopisk mikroskop, således at det øverste lag består af luftkanalens PDMS-plade og derefter PDMS-membranen.Mellemkanalen består af PDMS-pladen, derefter PDM-membranen, og bundlaget er luftkanalens PDMS-plade. Placer den samlede PDMS-chip i en 70 graders Celsius inkubator i en time. Forbered flere en millimeter indvendig diameter og tre centimeter længde latexslanger.Indsæt en en millimeter ydre diameter og en centimeter lang nål i rustfrit stål i den ene ende af den forberedte slange. Indsæt derefter et lokkemiddel i den anden ende af slangen for at skabe røret, der er forbundet med PDMS-chippens luft og mellemstore mikrokanaler. Indsæt de forberedte rør i udløb og indløb af luften og mellemstore mikrokanaler på PDMS-chippen.Tilsæt to milliliter 80 milligram pr. milliliter musekollagen i PDM-chippens mellemstore mikrokanal ved hjælp af en to milliliter sprøjte, og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter inkubation fjernes kollagenet fra kanalen med en to milliliter sprøjte. Placer de kollagenkodede PDMS-chips i en 60 graders Celsius-inkubator natten over.Anbring PDMS-chipsene i en UV-sterilisator i mere end en time. Placer de steriliserede PDMS-chips på en ultra ren bænk som forberedelse til celleeksperimentet. Kultur fire gange 10 til de fem primære humane aorta glatte muskelceller fra patienter, der bruger SMCM indeholdende 2% FBS og 1% penicillin streptomycin i en 5% kuldioxidinkubator, indstillet til 37 grader celsius.Når den glatte muskelcelletæthed når 80%, kasseres SMCM, og vask cellerne med to milliliter PPS. Fordøje cellerne ved hjælp af en milliliter 0,25% tripsin i to minutter og centrifuge ved 100 RCF i fem minutter. Fjern supernatanten og suspender cellepelleten i en milliliter frisk SMCM.Brug otte milliliter SMCM til at dyrke cellerne på en 10 centimeter kulturskål. Ved hjælp af et cytometer beregnes cellenummeret og fortsættes med den endelige koncentration på to gange 10 til de fem celler pr. Milliliter. Hæld langsomt to milliliter PBS i den kollagenkodede og steriliserede PDMS-chipmediummikrokanal og kasseres senere ved hjælp af en to milliliter sprøjte.Hæld langsomt to milliliter af to gange 10 til de fem celler pr. milliliter glat muskelcellesuspension i PDMS-chippens mediemikrokanal. Luk derefter lokket ved indgangen og udgangen af PDMS-chippen. Placer PDMS-chippen i en inkubator, indstillet til 37 grader celsius med 5% kuldioxid i en dag.Efter inkubation, når cellerne er fastgjort til PDMS-membranen i PDMS-chippen, skal du forbinde udløbet af luftmikrokanalen på PDMS-chippen til vakuumstyringssystemet. En langstrakt normal cellulær form vil blive set under mikroskopet, når cellen er fastgjort. I modsætning til de suspenderede runde celler.Tænd magnetventilen og vakuumpumpen. Åbn vakuumregulatoren, og juster trykniveauet afhængigt af stammerne. Placer derefter PDMS-chipsene og en inkubator indstillet til 37 grader celsius med 5% kuldioxid i 24 timer.Forbered flere magnetventiler, vakuumfiltre, vakuumregulatorer, en vakuumpumpe, en peristaltisk pumpe og en PLC, der styrer magnetventilen. Programmer PLC-controlleren, og indstil tænd fra-tidsintervallet til en hertz. Tilslut magnetventilerne til den programmerede controller.Tilslut vakuumpumpens indløb til vakuumfiltrene, og tilslut derefter vakuumfiltrenes udløb til vakuumregulatorerne. Tilslut vakuumregulatorernes udløb til magnetventiler. Og til sidst skal du forbinde udløbet af magnetventilerne til udløbene af PDMS-chipsens luftmikrokanaler.Tilslut udløbet af den peristaltiske pumpe til indløbet af PDMS-chippens mellemstore mikrokanal og indløbet af den peristaltiske pumpe til udløbet af den mellemstore mikrokanal PDMS-chip til udskiftning af kulturmedium og lægemiddelhåndtering. Juster amplituden af belastningen af regulatoren og belastningsfrekvensen af mikrocontrolleren. Levedygtigheden af den humane aorta glatte muskelcellelinje, CRL 1990, i PDMS-chippen, blev estimeret ved hjælp af et levende og dødt assay på den tredje og femte dag af cellekulturen.Cellelevedygtigheden blev fundet højere end 90% på dag tre og dag fem. Cytoskelet F-actin farvning af CRL 1990, i PDMS chip, viste normal cellemorfologi og celler justeret vinkelret på stammen efter strækning i 24 timer. Immunfluorescensen af de kontraktile markører SM22 og CNN1 var højere under belastningsforhold sammenlignet med de statiske tilstande.Også SM22- og CNN1-generne blev opreguleret under belastningsforhold for glatte muskelceller. F-actinfarvningen af BAV og TAV, thoraxaortaaneurisme og dissektion af patientafledte primære humane aortaglatte muskelceller viste normal cellemorfologi og celler justeret vinkelret på belastningsretningen efter strækning i 24 timer. SM22- og CNN1-fluorescensen i BAVTAAD og TAV thoraxaortaaneurisme og dissektion var højere under belastningsforhold end under statiske forhold.Svarende til genekspressionsniveauerne for SM22 og CNN1, som også blev opreguleret under belastningsforhold sammenlignet med statiske forhold. Der skal tages hensyn til sterilitetsprincippet ved isolering af primær HASMC. Efter at PDMS-laboratorierne og membranerne er behandlet med plasma, bør overfladerne ikke være snavsede.Baseret på denne protokol kan endotelceller samdyrkes med glatte muskelceller, og den rene stress kan gives til cellerne med cyklisk belastning for yderligere at simulere flere mekaniske kræfter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Instrueret Cellular saml-selv at fabrikere Cell-afledt Tissue Ringe til Biomekanisk analyse og Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human trofoblasten celler som en model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvågning af Wall Mekanik Under Stent Deployment i en beholder

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret metode til forberedelse af en menneskelig celle-baseret, Contact Model af blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Opførelse af en multicellulært 3D Stillads for levering af Layered celleark

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning af Electrospinning proces med at give tre unikke miljøer for en Tri-lags<em&gt; In vitro</em&gt; Model af Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust Paracellulær permeabilitet markør i en celle model af humant blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...