Name: construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall at JoVE.com

De auteurs erkennen dat dit werk werd ondersteund door subsidies van de Science and Technology Commission van de gemeente Shanghai (20ZR1411700), de National Natural Science Foundation of China (81771971) en het Shanghai Sailing Program (22YF1406600).

Menselijke aortamonsters werden gebruikt voor primaire HASMC-isolatie onder de goedkeuring van Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortamonsters werden verzameld van patiënten die een opgaande aorta-operatie ondergingen in het Zhongshan Hospital, Fudan University. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten vóór deelname.
1. Primaire menselijke aorta gladde spiercel isolatie
<ol><li>Was het rechter lateral...

<ol>
	<li>Olsson, C., Thelin, S., St&#229;hle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection:+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14,000+cases+from+1987+to+2002.">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li><li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+remodeling:+lessons+from+genetic+diseases.">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li><li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro.">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP/TAZ+signaling+pathway.">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li><li>Fabre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+a+manuscript+series+on+the+characterization+and+use+of+microphysiological+systems+(MPS)+in+pharmaceutical+safety+and+ADME+applications.">Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications.</a> Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).</li><li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans?+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection.">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li><li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro.">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li><li>Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+liver+models+on+a+microplatform:+well-defined+culture,+engineering+of+liver+tissue+and+liver-on-a-chip.">3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip.</a> Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-on-a-chip+based+on+stem+cell+biology.">Heart-on-a-chip based on stem cell biology.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).</li><li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity.">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).</li><li>Perestrelo, A. R., &#193;guas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ/body-on-a-chip+devices+at+the+convergence+of+biology+and+microengineering.">Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cancer-on-a-chip+for+drug+screening.">Construction of cancer-on-a-chip for drug screening.</a> Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+organ-on-a-chip+to+improve+cell+capture+efficiency.">Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency.</a> International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).</li><li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting.">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).</li><li>Mohammed, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+devices:+improvement+of+surface+quality+of+CO2+laser+machined+poly+(methylmethacrylate)+polymer.">Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).</li><li>Tsao, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+microfluidics:+Simple,+low-cost+fabrication+process+bridging+academic+lab+research+to+commercialized+production.">Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production.</a> Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).</li><li>Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+electrochemiluminescence+(ECL)+in+and+for+microfluidic+analytical+devices.">A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).</li><li>Stefanadis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-diameter+relation+of+the+human+aorta.+A+new+method+of+determination+by+the+application+of+a+special+ultrasonic+dimension+catheter.">Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter.</a> Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).</li><li>Williams, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+vascular+smooth+muscle+cell+function.">Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function.</a> Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).</li><li>Abudupataer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta+smooth+muscle-on-a-chip+reveals+impaired+mitochondrial+dynamics+as+a+therapeutic+target+for+aortic+aneurysm+in+bicuspid+aortic+valve+disease.">Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease.</a> eLife. 10, 69310 (2021).</li><li>Poussin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+human+microvessel-on-a-chip+model+for+studying+monocyte-to-endothelium+adhesion+under+flow+-+application+in+systems+toxicology.">3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology.</a> Altex. 1, 47-63 (2020).</li><li>Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artery-on-a-chip+platform+for+automated,+multimodal+assessment+of+cerebral+blood+vessel+structure+and+function.">Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function.</a> Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).</li></ol>

Met de snelle ontwikkeling van microfluïdische technologie zijn de afgelopen jaren OOC-modellen ontstaan die de biologische functie en structuur van een of meer organen in vitro kunnen repliceren voor toepassingen in de biologie, geneeskunde en farmacologie15. OOC kan sleutelfuncties van de menselijke fysiologische micro-omgeving simuleren, essentieel voor het verkennen van ziektemechanismen en het bevorderen van preklinische geneesmiddelvertaling 8,16<...

Thoracale aorta-aneurysma en dissectie (TAAD) is een gelokaliseerde dilatatie of delaminatie van de aortawand die geassocieerd is met hoge morbiditeit en mortaliteit1. Menselijke aorta gladde spiercellen (HASMC's) spelen een vitale rol in de pathogenese van TAAD. HASMC's zijn geen terminaal gedifferentieerde cellen en HASMC's behouden een hoge plasticiteit, waardoor ze van fenotype kunnen wisselen als reactie op verschillende stimuli2. HASMC's worden voornamelijk onderworpen aan ritmische trekspanning in vivo, en dit is een van de belangrijkste factoren die de morfologische veranderingen, differentiatie en fysiologische functies van gladde spieren reguleren 3,4. Daarom kan de rol van cyclische spanning in de studie van HASMC's niet worden genegeerd. Conventionele 2D-celculturen kunnen echter niet de biomechanische stimulatie van cyclische stam repliceren die hasmc's in vivo ervaren. Bovendien is de constructie van een dierlijk TAAD-model niet geschikt voor sommige soorten TAAD, zoals bicuspide aortaklep (BAV)-gerelateerde TAAD. Bovendien kan de soortenkloof tussen klinische menselijke studies en dierproeven niet worden genegeerd. Het belemmert farmaceutische vertaling in de klinische praktijk. Er is dus dringend behoefte aan complexere en fysiologische systemen om de in vivo biomechanische omgeving te simuleren in het onderzoek naar aortaziekten.
Dierproeven die worden gebruikt in biomedisch onderzoek en medicijnontwikkeling zijn kostbaar, tijdrovend en ethisch twijfelachtig. Bovendien voorspellen de resultaten van dierstudies vaak niet de resultaten die zijn verkregen in klinische onderzoeken bij mensen 5,6. Het gebrek aan menselijke preklinische modellen en het hoge faalpercentage in klinische onderzoeken hebben geresulteerd in weinig effectieve geneesmiddelen voor de kliniek, waardoor de kosten van de gezondheidszorg zijngestegen 7. Het is dus dringend noodzakelijk om andere experimentele modellen te vinden als aanvulling op diermodellen. Microfabricage en microfluïdische technieken hebben zich de afgelopen jaren sterk ontwikkeld en bieden nieuwe technieken voor het opzetten van organoïden-op-een-chip-modellen die de nadelen van traditionele 2D-celkweektechnieken verhelpen en een realistischer, goedkoper en efficiënter in vitro model opstellen voor fysiologische studies en medicijnontwikkeling. Met behulp van microfluïdische apparaten worden organen-op-chips opgericht om levende cellen te kweken in kamers van micrometerformaat met verschillende stimuli om de belangrijkste functies van een weefsel of orgaan te repliceren. Het systeem bestaat uit enkele of meerdere microfluïdische microkanalen, met ofwel één soort cel gekweekt in een doordrenkte kamer die functies van één weefseltype repliceert of verschillende celtypen gekweekt op poreuze membranen om interfaces tussen verschillende weefsels te recreëren. Microfluïdische organoïden in combinatie met van de patiënt afgeleide cellen hebben het unieke voordeel dat ze het grote soortverschil tussen muis- en menselijke ziektemodellen overbruggen en de nadelen van traditionele 2D-celcultuur voor onderzoek naar ziektemechanismen en medicijnontdekking overwinnen. Met de snelle ontwikkeling van microfluïdica in de afgelopen jaren, hebben onderzoekers het nut gerealiseerd van in vitro organ-on-a-chip (OOC) modellen die complexe in vivo biologische parameters repliceren8. Deze microfluïdische organoïden simuleren in vitro biomechanische omgevingen, zoals cyclische spanning, schuifspanning en vloeistofdruk, en bieden een driedimensionale (3D) celkweekomgeving. Tot op heden zijn verschillende OOC-modellen opgesteld om biomechanische stimuli in organen zoals long9, nier10, lever 11, darm12 en hart13 te simuleren, maar deze zijn niet op grote schaal toegepast op de studie van menselijke aortaziekte.
In deze studie presenteren we een menselijk aorta gladde spiercel orgaan-op-een-chip (HASMC-OOC) model dat de biomimetische mechanische krachten en ritmes kan regelen die worden toegepast op TAAD-patiënt-afgeleide primaire HASMC's. De chip bestaat uit drielaagse dikke platen polydimethylsiloxaan (PDMS) geëtst met kanalen en twee gecommercialiseerde zeer flexibele PDMS-membranen. HASMC's worden gekweekt op de PDMS-membranen. Het kanaal in het midden van de chip is gevuld met een kweekmedium voor celkweek. De bovenste en onderste kanalen van de chip zijn verbonden met een vacuümdruktoevoersysteem dat het ritme en de frequentie van de mechanische trekspanning van de PDMS-membranen kan regelen. Ritmische spanning ervaren door HASMC's kan worden gesimuleerd in HASMC-OOC, waarbij de biomechanische micro-omgeving van weefsel of orgaan wordt gerepliceerd die niet functioneel haalbaar is met conventionele 2D-kweeksystemen. Met het voordeel van hoge resolutie, real-time beeldvorming en biomechanische micro-omgeving, kunnen de biochemische, genetische en metabole activiteiten van levende cellen worden bestudeerd voor weefselontwikkeling, orgaanfysiologie, ziekte-etiologie, moleculaire mechanismen en biomarkeridentificatie, hart- en vaatziekten en aortaziekte. In combinatie met weefselspecifieke en patiëntcellen kan dit systeem worden gebruikt voor geneesmiddelenscreening, gepersonaliseerde geneeskunde en toxiciteitstests. Dit HASMC-OOC-model biedt een nieuw in vitro platform voor het bestuderen van de pathogenese van de aortaziekte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td>Used for cell immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0408</td>
			<td>Antibodies used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST025-20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium AM/PI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Ab46794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flexible 
			PDMS membrane</td>
			<td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td>
			<td>KYQ-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoses</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>96410</td>
			<td>1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human aortic smooth 
			muscle cell line CRL1999</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Lot Number:70019189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Imagej.net/fiji/downloads</td>
			<td>Free Download: https://fiji.sc</td>
			<td>Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ensures that the temperature, 
			humidity, and light exposure is 
			exactly the same throughout 
			experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>RH-M016</td>
			<td>Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse collagen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma&#160;</td>
			<td>Changzhou Hongming Instrument</td>
			<td>HM-Plasma5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>30-0138A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0221A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458-100ml</td>
			<td>Antibiodics used to prevent bacterial 
			contamination of cells during culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>F01A-STP-B046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC controller</td>
			<td>Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory</td>
			<td>BR010-11T8X2M</td>
			<td>The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMCM</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>Cat 1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>VQZ300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST795</td>
			<td>To penetrate cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filter</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>ZFC5-6</td>
			<td>Official website address: https://www.smc.com.cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>KVP15-KL-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum regulator</td>
			<td>AirTAC</td>
			<td>GVR-200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Name</td>
			<td>Forward (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td>Reverse (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td>
			<td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td>
			<td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall

Conventionele tweedimensionale celkweektechnieken en diermodellen zijn gebruikt bij de studie van humaan thoracale aorta-aneurysma en dissectie (TAAD). Menselijke TAAD kan echter soms niet worden gekarakteriseerd door diermodellen. Er is een duidelijke soortkloof tussen klinische menselijke studies en dierproeven die de ontdekking van therapeutische geneesmiddelen kunnen belemmeren. Het conventionele celkweekmodel is daarentegen niet in staat om in vivo biomechanische stimuli te simuleren. Hiertoe hebben microfabricage en microfluïdische technieken zich de afgelopen jaren sterk ontwikkeld en nieuwe technieken opgeleverd voor het opzetten van organoïden-op-een-chip-modellen die de biomechanische micro-omgeving repliceren. In deze studie werd een humaan aorta glad spiercelorgaan-op-een-chip (HASMC-OOC) model ontwikkeld om de pathofysiologische parameters van de aortabiomechanica te simuleren, inclusief de amplitude en frequentie van cyclische spanning ervaren door menselijke aorta gladde spiercellen (HASMC's) die een vitale rol spelen in TAAD. In dit model werd de morfologie van HASMC's langwerpig van vorm, loodrecht op de stamrichting uitgelijnd en presenteerde een meer contractiel fenotype onder spanningsomstandigheden dan onder statische conventionele omstandigheden. Dit kwam overeen met de celoriëntatie en het fenotype in inheemse menselijke aortawanden. Bovendien hebben we, met behulp van bicuspid aortaklep-gerelateerde TAAD (BAV-TAAD) en tricuspidalis aortaklep-gerelateerde TAAD (TAV-TAAD) patiënt-afgeleide primaire HASMC's, BAV-TAAD en TAV-TAAD ziektemodellen opgesteld, die HASMC-kenmerken in TAAD repliceren. Het HASMC-OOC-model biedt een nieuw in vitro platform dat complementair is aan diermodellen voor het verder onderzoeken van de pathogenese van TAAD en het ontdekken van therapeutische doelen.

Het HASMC-OOC-model bestaat uit een vacuümbesturingssysteem, een circulatiesysteem en PDMS-chips en het schematische ontwerp van het HASMC-OOC-model (figuur 1). Het vacuümbesturingssysteem bestaat uit een vacuümpomp, magneetventielen en een PLC-besturing. Om als circulatiesysteem te fungeren, werd een peristaltische pomp gebruikt om het celkweekmedium te vernieuwen en medicijnen toe te voegen. De PDMS-chip bestond uit twee vacuümkamers en een middelste kamer gevuld met SMCM voor celgroei...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall at JoVE.com

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Hier ontwikkelden we een menselijk aorta gladde spiercel orgaan-op-een-chip model om de in vivo biomechanische stam van gladde spiercellen in de menselijke aortawand te repliceren.

Constructie van een humane Aorta gladde spiercel orgaan-op-A-chip model voor het recapuleren van biomechanische stam in de aortawand

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Dit model stimuleert biomechanische prikkels die worden ervaren door gladde spiercellen in menselijke aorta. In combinatie met van patiënten afgeleide cellen kan dit systeem worden gebruikt voor geneesmiddelenscreening en gepersonaliseerde geneeskunde van aortaziekten. Dit model kan de kale mechanische parameters van de gladde spiercellen in menselijke aorta nabootsen en nauwkeurig regelen, wat een nieuw in vitro platform biedt voor het bestuderen en pathogenese van aortaziekten.Mieradilijiang Abudubat, een posterdokter van ons laboratorium, demonstreert de procedure. Begin met het wassen van het rechter laterale gebied van de opgaande aorta met steriele pbs, een of twee keer. Verwijder de intima en een adventitia lagen van het weefsel met twee oogheelkundige tangen en behoud de medialaag om de cellen te oogsten.Leg de medialaag op een schaal van 10 centimeter en snijd deze in stukken van twee tot drie millimeter. Voeg vervolgens vijf milliliter SMCM met 10% fbs en 1% penicilline streptomycine toe aan de weefselmonsters. Verplaats het kleine weefsel in de kweekfles met een steriele druppelaar en verspreid het weefsel gelijkmatig.Gooi het kweekmedium zoveel mogelijk weg. Keer de fles vervolgens ondersteboven om. Voeg twee milliliter SMCM toe aan de omgekeerde kweekfles en plaats deze in de incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur.Draai het vervolgens langzaam naar rechts en voeg nog eens twee milliliter SMCM toe. Na vijf tot zeven dagen incubatie verwisselt u de SMCM met vier milliliter verse SMCM. Gooi de SMCM langzaam weg en voeg deze toe bij het vervangen van het medium.Over het algemeen klimmen sporadische gladde spiercellen in ongeveer twee weken uit. Transporteer de kweekfles voorzichtig wanneer u naar een microscoopstation gaat. Anders zullen de weefsels drijven en zullen de cellen langzaam groeien.Wanneer de cellen zijn gegroeid, deel ze dan in twee nieuwe kweekflessen met vier milliliter verse SMCM. Identificeer de cellen door middel van een immunofluorescentieanalyse van vier specifieke markers voor gladde spiercellen. Om PDMS te polymeriseren, voegt u het uithardingsmiddel of de B-component toe aan de basis of de A-component en mengt u het complex gedurende vijf minuten.Het volume zal afhangen van de noodzaak van het onderzoek. Plaats de bereide PDMS-gel gedurende 30 tot 60 minuten in een vacuümafzuigtank en houd de druk onder negatief 0,8 milli pascal. Ontwerp de matrijs met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware.Maak op maat de mallen van de drie lagen met behulp van een hoge precisie computer numerieke controle graveermachine. Nadat u het frame van de mallen en de microkanalen hebt uitgesneden met BEHULP VAN PMMA-platen, lijmt u ze op een andere plaat. Giet de voorbereide PDMS-gel op een ontworpen mal.Vervolgens cross-link bij 70 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Verwijder de verknoopte PDMS-platen van de mal en snijd de gecommercialiseerde PDMS-membranen in secties van 100 millimeter bij 40 millimeter. Pons gaten op de drie PDM-platen met behulp van een perforator van één millimeter om de in- en uitlaat van lucht en middelgrote microkanalen op de PDMS-chip te maken.Behandel de drie voorbereide PDMS-platen en twee PDMS-membranen gedurende vijf minuten met zuurstofplasma voor PDM-oppervlakteactivering. Stel de ruimtelucht in op het verwerken van gas, de druk op negatief 100 kilopascal, de stroom op 180 tot 200 milliampère, de spanning op 200 volt en de verwerkingstijd op vijf minuten. Verlijm drie PDMS-platen en twee PDMS-membranen aan elkaar onder een stereoscopische microscoop, zodat de bovenste laag bestaat uit de pdms-plaat van het luchtkanaal en vervolgens uit het PDMS-membraan.Het mediumkanaal bestaat uit de PDMS-plaat, vervolgens het PDM-membraan en de onderste laag is de PDMS-plaat van het luchtkanaal. Plaats de geassembleerde PDMS-chip gedurende een uur in een incubator van 70 graden Celsius. Bereid enkele binnendiameters van één millimeter en latexslangen van drie centimeter lengte voor.Steek een buitendiameter van één millimeter en een centimeter lange roestvrijstalen naald in het ene uiteinde van de voorbereide slang. Steek vervolgens een lokmiddel in het andere uiteinde van de slang om de buis te maken die is aangesloten op de lucht- en mediummicrokanalen van de PDMS-chip. Plaats de voorbereide buizen in de uitlaten en inlaten van de lucht en middelgrote microkanalen op de PDMS-chip.Injecteer twee milliliter van 80 milligram per milliliter muiscollageen in het medium microkanaal van de PDMs-chip, met behulp van een spuit van twee milliliter, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder na incubatie het collageen uit het kanaal met een spuit van twee milliliter. Plaats de collageen gecodeerde PDMS-chips 's nachts in een incubator van 60 graden Celsius.Plaats de PDMS-chips langer dan een uur in een UV-sterilisator. Plaats de gesteriliseerde PDMS-chips op een ultraschone bank ter voorbereiding op het celexperiment. Kweek vier keer 10 tot de vijf primaire menselijke aorta gladde spiercellen van patiënten die SMCM gebruiken met 2% FBS en 1% penicilline streptomycine in een 5% kooldioxide-incubator, ingesteld op 37 graden Celsius.Wanneer de dichtheid van de gladde spiercellen 80% bereikt, gooit u de SMCM weg en wast u de cellen met twee milliliter PPS. Verteer de cellen met één milliliter van 0,25% tripsine gedurende twee minuten en centrifugeer op 100 RCF gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in één milliliter verse SMCM.Gebruik acht milliliter SMCM om de cellen op een kweekschaal van 10 centimeter te kweken. Bereken met behulp van een cytometer het celnummer en ga verder met de uiteindelijke concentratie van twee keer 10 tot de vijf cellen per milliliter. Giet langzaam twee milliliter PBS in het collageen gecodeerde en gesteriliseerde PDMS-chipmediummicrokanaal en gooi het later weg met een spuit van twee milliliter.Giet langzaam twee milliliter van twee keer 10 naar de vijf cellen per milliliter gladde spiercelsuspensie in het mediamicrokanaal van de PDMS-chip. Sluit vervolgens het kunstaas bij de in- en uitgang van de PDMS-chip. Plaats de PDMS-chip in een incubator, ingesteld op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide voor één dag.Na incubatie, wanneer de cellen zijn bevestigd aan het PDMS-membraan in de PDMS-chip, sluit u de uitlaat van het luchtmicrokanaal op de PDMS-chip aan op het vacuümcontrollersysteem. Een langwerpige normale cellulaire vorm zal onder de microscoop worden gezien wanneer de cel is bevestigd. In tegenstelling tot de zwevende ronde cellen.Schakel de magneetklep en de vacuümpomp in. Open de vacuümregelaar en pas het drukniveau aan, afhankelijk van de stammen. Plaats vervolgens de PDMS-chips en een incubator ingesteld op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.Bereid verschillende magneetventielen, vacuümfilters, vacuümregelaars, een vacuümpomp, een peristaltische pomp en een PLC voor die de magneetklep bestuurt. Programmeer de PLC-controller en stel het aan-uit-tijdsinterval in op één hertz. Sluit de magneetventielen aan op de geprogrammeerde controller.Sluit de inlaat van de vacuümpomp aan op de vacuümfilters en sluit vervolgens de uitlaat van de vacuümfilters aan op de vacuümregelaars. Sluit de uitlaat van de vacuümregelaars aan op magneetventielen. En sluit ten slotte de uitlaat van de magneetventielen aan op de uitgangen van de luchtmicrokanalen van de PDMS-chips.Sluit de uitlaat van de peristaltische pomp aan op de inlaat van het medium microkanaal van de PDMS-chip en de inlaat van de peristaltische pomp op de uitlaat van de medium microkanaal PDMS-chip voor vervanging van kweekmedium en medicijnbehandeling. Pas de amplitude van de spanning aan door de regelaar en de spanningsfrequentie door de microcontroller. De levensvatbaarheid van de menselijke aorta gladde spiercellijn, CRL 1990, in de PDMS-chip, werd geschat met behulp van een levende en dode test op de derde en vijfde dag van celkweek.De levensvatbaarheid van de cel werd hoger gevonden dan 90% op dag drie en dag vijf. Cytoskelet F-actinekleuring van CRL 1990, in de PDMS-chip, vertoonde normale celmorfologie en cellen die loodrecht op de stam stonden na 24 uur uitrekken. Immunofluorescentie van de contractiele markers SM22 en CNN1 was hoger onder stamomstandigheden in vergelijking met de statische omstandigheden.Ook werden de SM22- en CNN1-genen geupreguleerd in spanningsomstandigheden van gladde spiercellen. De F-actinekleuring van BAV en TAV, thoracale aorta-aneurysma en dissectie van patiënt-afgeleide primaire menselijke aorta gladde spiercellen, toonde normale celmorfologie en cellen loodrecht op de stamrichting uitgelijnd na rek gedurende 24 uur. De SM22- en CNN1-fluorescentie in BAVTAAD en TAV thoracale aorta-aneurysma en dissectie waren hoger onder spanningsomstandigheden dan onder statische omstandigheden.Vergelijkbaar met de genexpressieniveaus van SM22 en CNN1, die ook in stamomstandigheden werden geupreguleerd in vergelijking met statische omstandigheden. Er moet aandacht worden besteed aan het principe van steriliteit bij het isoleren van primaire HASMC. Nadat de PDMS-laboratoria en de membranen met plasma zijn behandeld, mogen de oppervlakken niet worden bevuild.Op basis van dit protocol kunnen endotheelcellen samen worden gekweekt met gladde spiercellen en kan de pure spanning worden gegeven aan de cellen met cyclische spanning om meer mechanische krachten verder te simuleren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Monitoring van de Muur Mechanics Tijdens stent in een bloedvat

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de Airway Muur

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer geel-een robuuste Paracellulaire permeabiliteit marker in een Celmodel van de menselijke bloed-hersen barrière

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...