Name: construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00
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Les auteurs reconnaissent que ce travail a été soutenu par des subventions de la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (20ZR1411700), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81771971) et du programme de voile de Shanghai (22YF1406600).

Des échantillons aortiques humains ont été utilisés pour l’isolement primaire HASMC sous l’approbation du comité d’éthique de l’hôpital Zhongshan de l’Université Fudan (NO. B2020-158). Des échantillons aortiques ont été prélevés chez des patients ayant subi une chirurgie de l’aorte ascendante à l’hôpital Zhongshan de l’Université Fudan. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients avant la participation.
1. Isolement primaire des ce...

<ol>
	<li>Olsson, C., Thelin, S., St&#229;hle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection:+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14,000+cases+from+1987+to+2002.">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li><li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+remodeling:+lessons+from+genetic+diseases.">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li><li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro.">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP/TAZ+signaling+pathway.">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li><li>Fabre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+a+manuscript+series+on+the+characterization+and+use+of+microphysiological+systems+(MPS)+in+pharmaceutical+safety+and+ADME+applications.">Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications.</a> Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).</li><li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans?+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection.">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li><li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro.">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li><li>Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+liver+models+on+a+microplatform:+well-defined+culture,+engineering+of+liver+tissue+and+liver-on-a-chip.">3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip.</a> Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-on-a-chip+based+on+stem+cell+biology.">Heart-on-a-chip based on stem cell biology.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).</li><li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity.">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).</li><li>Perestrelo, A. R., &#193;guas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ/body-on-a-chip+devices+at+the+convergence+of+biology+and+microengineering.">Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cancer-on-a-chip+for+drug+screening.">Construction of cancer-on-a-chip for drug screening.</a> Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+organ-on-a-chip+to+improve+cell+capture+efficiency.">Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency.</a> International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).</li><li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting.">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).</li><li>Mohammed, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+devices:+improvement+of+surface+quality+of+CO2+laser+machined+poly+(methylmethacrylate)+polymer.">Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).</li><li>Tsao, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+microfluidics:+Simple,+low-cost+fabrication+process+bridging+academic+lab+research+to+commercialized+production.">Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production.</a> Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).</li><li>Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+electrochemiluminescence+(ECL)+in+and+for+microfluidic+analytical+devices.">A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).</li><li>Stefanadis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-diameter+relation+of+the+human+aorta.+A+new+method+of+determination+by+the+application+of+a+special+ultrasonic+dimension+catheter.">Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter.</a> Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).</li><li>Williams, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+vascular+smooth+muscle+cell+function.">Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function.</a> Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).</li><li>Abudupataer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta+smooth+muscle-on-a-chip+reveals+impaired+mitochondrial+dynamics+as+a+therapeutic+target+for+aortic+aneurysm+in+bicuspid+aortic+valve+disease.">Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease.</a> eLife. 10, 69310 (2021).</li><li>Poussin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+human+microvessel-on-a-chip+model+for+studying+monocyte-to-endothelium+adhesion+under+flow+-+application+in+systems+toxicology.">3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology.</a> Altex. 1, 47-63 (2020).</li><li>Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artery-on-a-chip+platform+for+automated,+multimodal+assessment+of+cerebral+blood+vessel+structure+and+function.">Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function.</a> Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).</li></ol>

Avec le développement rapide de la technologie microfluidique, des modèles OOC capables de reproduire la fonction biologique et la structure d’un ou plusieurs organes in vitro ont émergé ces dernières années pour des applications en biologie, médecine et pharmacologie15. OOC peut simuler des fonctions clés du microenvironnement physiologique humain, essentiel pour explorer les mécanismes de la maladie et promouvoir la traduction précliniquedes médicaments</s...

L’anévrisme et la dissection de l’aorte thoracique (TAAD) sont une dilatation ou une délamination localisée de la paroi aortique associée à une morbidité et une mortalité élevées1. Les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse du TAAD. Les HASMC ne sont pas des cellules différenciées en phase terminale, et les HASMC conservent une plasticité élevée, ce qui leur permet de changer de phénotype en réponse à différents stimuli2. Les HASMC sont principalement soumis à une contrainte de traction rythmique in vivo, et c’est l’un des facteurs clés régulant les changements morphologiques des muscles lisses, la différenciation et les fonctions physiologiques 3,4. Par conséquent, le rôle de la déformation cyclique dans l’étude des HASMC ne peut être ignoré. Cependant, les cultures cellulaires 2D conventionnelles ne peuvent pas reproduire la stimulation biomécanique de la souche cyclique subie par les HASMC in vivo. De plus, la construction d’un modèle TAAD animal ne convient pas à certains types de TAAD, tels que le TAAD lié à la valve aortique bicuspide (BAV). De plus, l’écart entre les études cliniques sur l’homme et l’expérimentation animale ne peut être ignoré. Elle entrave la traduction pharmaceutique dans la pratique clinique. Ainsi, il existe un besoin urgent de systèmes physiologiques plus complexes pour simuler l’environnement biomécanique in vivo dans la recherche sur les maladies de l’aorte.
Les expériences sur les animaux utilisées dans la recherche biomédicale et le développement de médicaments sont coûteuses, longues et éthiquement discutables. En outre, les résultats des études animales ne permettent souvent pas de prédire les résultats obtenus dans les essais cliniques chez l’homme 5,6. L’absence de modèles précliniques humains et le taux élevé d’échec dans les essais cliniques ont entraîné peu de médicaments efficaces pour la clinique, ce qui a augmenté les coûts des soins de santé7. Il est donc urgent de trouver d’autres modèles expérimentaux pour compléter les modèles animaux. Les techniques de microfabrication et de microfluidique se sont considérablement développées ces dernières années, fournissant de nouvelles techniques pour établir des modèles organoïdes sur puce qui remédient aux inconvénients des techniques traditionnelles de culture cellulaire 2D et établissent un modèle in vitro plus réaliste, peu coûteux et efficace pour les études physiologiques et le développement de médicaments. À l’aide de dispositifs microfluidiques, des organes sur puce sont établis pour cultiver des cellules vivantes dans des chambres de taille micrométrique avec différents stimuli pour reproduire les fonctions clés d’un tissu ou d’un organe. Le système se compose d’un ou de plusieurs microcanaux microfluidiques, avec soit un type de cellule cultivée dans une chambre perfusée répliquant des fonctions d’un type de tissu, soit différents types de cellules cultivées sur des membranes poreuses pour recréer des interfaces entre différents tissus. Les organoïdes microfluidiques combinés à des cellules dérivées de patients ont l’avantage unique de combler la grande différence d’espèces entre les modèles de maladies de souris et d’humains et de surmonter les inconvénients de la culture cellulaire 2D traditionnelle pour la recherche sur le mécanisme de la maladie et la découverte de médicaments. Avec le développement rapide de la microfluidique au cours des dernières années, les chercheurs ont réalisé l’utilité des modèles in vitro d’organes sur puce (OOC) répliquant des paramètres biologiques complexes in vivo 8. Ces organoïdes microfluidiques simulent des environnements biomécaniques in vitro, tels que la déformation cyclique, la contrainte de cisaillement et la pression du liquide, fournissant un environnement de culture cellulaire tridimensionnel (3D). À ce jour, plusieurs modèles OOC ont été établis pour simuler des stimuli biomécaniques dans des organes tels que le poumon9, le rein 10, le foie11, l’intestin 12 et le cœur 13, mais ceux-ci n’ont pas été largement appliqués à l’étude de la maladie aortique humaine.
Dans cette étude, nous présentons un modèle HASMC-OOC (Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ On-A-Chip) qui peut contrôler les forces et les rythmes mécaniques biomimétiques appliqués aux HASMC primaires dérivés du patient TAAD. La puce se compose de plaques épaisses à trois couches de polydiméthylsiloxane (PDMS) gravées avec des canaux et de deux membranes PDMS hautement flexibles commercialisées. Les HASMC sont cultivés sur les membranes PDMS. Le canal au milieu de la puce est rempli d’un milieu de culture pour la culture cellulaire. Les canaux supérieur et inférieur de la puce sont connectés à un système d’alimentation en pression sous vide qui peut contrôler le rythme et la fréquence de la déformation mécanique de traction des membranes PDMS. La contrainte rythmique subie par les HASMC peut être simulée dans HASMC-OOC, reproduisant le microenvironnement biomécanique des tissus ou des organes qui n’est pas fonctionnellement réalisable avec les systèmes de culture 2D conventionnels. Avec l’avantage de l’imagerie en temps réel à haute résolution et du microenvironnement biomécanique, les activités biochimiques, génétiques et métaboliques des cellules vivantes peuvent être étudiées pour le développement tissulaire, la physiologie des organes, l’étiologie de la maladie, les mécanismes moléculaires et l’identification des biomarqueurs, les maladies cardiovasculaires et les maladies aortiques. Combiné avec des cellules spécifiques aux tissus et aux patients, ce système peut être utilisé pour le dépistage de médicaments, la médecine personnalisée et les tests de toxicité. Ce modèle HASMC-OOC fournit une nouvelle plateforme in vitro pour étudier la pathogenèse de la maladie aortique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td>Used for cell immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0408</td>
			<td>Antibodies used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST025-20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium AM/PI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Ab46794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flexible 
			PDMS membrane</td>
			<td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td>
			<td>KYQ-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoses</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>96410</td>
			<td>1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human aortic smooth 
			muscle cell line CRL1999</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Lot Number:70019189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Imagej.net/fiji/downloads</td>
			<td>Free Download: https://fiji.sc</td>
			<td>Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ensures that the temperature, 
			humidity, and light exposure is 
			exactly the same throughout 
			experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>RH-M016</td>
			<td>Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse collagen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma&#160;</td>
			<td>Changzhou Hongming Instrument</td>
			<td>HM-Plasma5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>30-0138A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0221A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458-100ml</td>
			<td>Antibiodics used to prevent bacterial 
			contamination of cells during culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>F01A-STP-B046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC controller</td>
			<td>Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory</td>
			<td>BR010-11T8X2M</td>
			<td>The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMCM</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>Cat 1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>VQZ300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST795</td>
			<td>To penetrate cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filter</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>ZFC5-6</td>
			<td>Official website address: https://www.smc.com.cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>KVP15-KL-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum regulator</td>
			<td>AirTAC</td>
			<td>GVR-200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Name</td>
			<td>Forward (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td>Reverse (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td>
			<td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td>
			<td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall

Des techniques conventionnelles de culture cellulaire bidimensionnelle et des modèles animaux ont été utilisés dans l’étude de l’anévrisme et de la dissection de l’aorte thoracique humaine (TAAD). Cependant, le TAAD humain ne peut parfois pas être caractérisé par des modèles animaux. Il existe un écart apparent entre les études cliniques sur les humains et les expériences sur les animaux qui peut entraver la découverte de médicaments thérapeutiques. En revanche, le modèle de culture cellulaire conventionnel est incapable de simuler des stimuli biomécaniques in vivo . À cette fin, les techniques de microfabrication et de microfluidique se sont considérablement développées ces dernières années, fournissant de nouvelles techniques pour établir des modèles organoïdes sur puce qui reproduisent le microenvironnement biomécanique. Dans cette étude, un modèle HASMC-OOC (Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-on-a-Chip) a été développé pour simuler les paramètres physiopathologiques de la biomécanique aortique, y compris l’amplitude et la fréquence de la déformation cyclique subie par les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) qui jouent un rôle vital dans TAAD. Dans ce modèle, la morphologie des HASMC est devenue allongée, alignée perpendiculairement à la direction de la déformation et présentait un phénotype plus contractile dans des conditions de déformation que dans des conditions conventionnelles statiques. Cela était cohérent avec l’orientation cellulaire et le phénotype dans les parois aortiques humaines natives. De plus, en utilisant des TAAD liés à la valve aortique bicuspide (BAV-TAAD) et des HASMC primaires dérivés des patients liés à la valve aortique tricuspide (TAV-TAAD), nous avons établi des modèles de maladie BAV-TAAD et TAV-TAAD, qui reproduisent les caractéristiques HASMC dans TAAD. Le modèle HASMC-OOC fournit une nouvelle plateforme in vitro complémentaire aux modèles animaux pour explorer davantage la pathogenèse du TAAD et découvrir des cibles thérapeutiques.

Le modèle HASMC-OOC se compose d’un système de contrôle du vide, d’un système de circulation et de puces PDMS, ainsi que de la conception schématique du modèle HASMC-OOC (Figure 1). Le système de contrôle du vide se compose d’une pompe à vide, d’électrovannes et d’un contrôleur PLC. Pour agir comme système circulant, une pompe péristaltique a été utilisée pour rafraîchir le milieu de culture cellulaire et ajouter des médicaments. La puce PDMS était composée de d...

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Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Ici, nous avons développé un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour reproduire la souche biomécanique in vivo des cellules musculaires lisses dans la paroi aortique humaine.

Construction d’un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour récapituler la contrainte biomécanique dans la paroi aortique

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Ce modèle stimule les stimuli biomécaniques ressentis par les cellules musculaires lisses de l’aorte humaine. Combiné avec des cellules dérivées de patients, ce système peut être utilisé pour le dépistage de médicaments et la médecine personnalisée des maladies de l’aorte. Ce modèle peut imiter et contrôler avec précision les paramètres mécaniques nus, des cellules musculaires lisses de l’aorte humaine, ce qui fournit une nouvelle plate-forme in vitro pour l’étude et la pathogenèse des maladies aortiques.La démonstration de la procédure sera Mieradilijiang Abudubat, un médecin posteriste de notre laboratoire. Commencez par laver la région latérale droite de l’aorte ascendante avec des PBS stériles, une ou deux fois. Retirez les couches intima et adventice du tissu à l’aide de deux pinces ophtalmiques et conservez la couche de média pour prélever les cellules.Placez la couche de média sur une boîte de 10 centimètres et coupez-la en morceaux de deux à trois millimètres. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de SMCM contenant 10% fbs et 1% de pénicilline streptomycine aux échantillons de tissus. Déplacez le petit tissu dans le flacon de culture avec un compte-gouttes stérile, en répartissant le tissu uniformément.Jetez le milieu de culture autant que possible. Ensuite, retournez la bouteille à l’envers. Ajoutez deux millilitres de SMCM dans la bouteille de culture inversée et placez-la dans l’incubateur avec 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures.Ensuite, tournez-le lentement vers le haut et ajoutez deux autres millilitres de SMCM. Après cinq à sept jours d’incubation, échangez le SMCM avec quatre millilitres de SMCM frais. Jetez lentement et ajoutez le SMCM lors du changement du support.Généralement, les cellules musculaires lisses sporadiques disparaissent en environ deux semaines. Transportez doucement la bouteille de culture lorsque vous vous déplacez vers une station de microscope. Sinon, les tissus flotteront et les cellules se développeront lentement.Lorsque les cellules ont grandi, divisez-les en deux nouvelles bouteilles de culture avec quatre millilitres de SMCM frais. Identifier les cellules grâce à une analyse d’immunofluorescence de quatre marqueurs spécifiques pour les cellules musculaires lisses. Pour polymériser le PDMS, ajoutez l’agent de durcissement ou le composant B à la base ou au composant A et mélangez le complexe pendant cinq minutes.Le volume dépendra de la nécessité de l’étude. Placez le gel PDMS préparé dans un réservoir d’extraction sous vide pendant 30 à 60 minutes et maintenez la pression en dessous de 0,8 milli pascals négatifs. À l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur, concevez le moule.Fabriquez sur mesure les moules des trois couches à l’aide d’une machine de gravure à commande numérique par ordinateur de haute précision. Après avoir découpé le cadre des moules et des microcanaux à l’aide de plaques de PMMA, collez-les sur une autre plaque. Versez le gel PDMS préparé sur un moule conçu.Ensuite, réticulez à 70 degrés Celsius pendant une à deux heures. Décollez les dalles PDMS réticulées du moule et coupez les membranes PDMS commercialisées en sections de 100 millimètres sur 40 millimètres. Perforez des trous sur les trois dalles PDM à l’aide d’un perforateur d’un millimètre pour faire l’entrée et la sortie d’air et de microcanaux moyens sur la puce PDMS.Traiter les trois dalles PDMS préparées et les deux membranes PDMS avec du plasma d’oxygène pendant cinq minutes pour l’activation de la surface PDM. Réglez l’air ambiant pour traiter le gaz, la pression sur les couches négatives de 100 kilopascals, le courant sur les piliers de 180 à 200 milliampères, la tension sur 200 volts et le temps de traitement sur cinq minutes. Lier trois dalles PDMS et deux membranes PDMS ensemble sous un microscope stéréoscopique, de sorte que la couche supérieure soit constituée de la dalle PDMS du canal d’air, puis de la membrane PDMS.Le canal moyen est constitué de la dalle PDMS, puis de la membrane PDM, et la couche inférieure est la dalle PDMS du canal d’air. Placez la puce PDMS assemblée dans un incubateur à 70 degrés Celsius pendant une heure. Préparez plusieurs tuyaux en latex d’un millimètre de diamètre intérieur et de trois centimètres de longueur.Insérez une aiguille en acier inoxydable d’un millimètre de diamètre extérieur et d’un centimètre de long dans une extrémité du tuyau préparé. Insérez ensuite un leurre dans l’autre extrémité du tuyau pour créer le tube connecté aux microcanaux d’air et de milieu de la puce PDMS. Insérez les tubes préparés dans les sorties et les entrées de l’air et les microcanaux moyens sur la puce PDMS.Infuser deux millilitres de 80 milligrammes par millilitre de collagène de souris dans le microcanal moyen de la puce PDM, à l’aide d’une seringue de deux millilitres, et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez le collagène du canal avec une seringue de deux millilitres. Placez les puces PDMS codées au collagène dans un incubateur à 60 degrés Celsius pendant la nuit.Placez les puces PDMS dans un stérilisateur UV pendant plus d’une heure. Placez les puces PDMS stérilisées sur un banc ultra propre en préparation de l’expérience cellulaire. Culture quatre fois 10 aux cinq cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires de patients utilisant SMCM contenant 2% FBS et 1% de pénicilline streptomycine dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5%, réglé à 37 degrés Celsius.Lorsque la densité des cellules musculaires lisses atteint 80%, jetez le SMCM et lavez les cellules avec deux millilitres de PPS. Digérer les cellules en utilisant un millilitre de 0,25% de tripsine pendant deux minutes et centrifuger à 100 RCF pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de SMCM frais.Utilisez huit millilitres de SMCM pour cultiver les cellules sur une boîte de culture de 10 centimètres. À l’aide d’un cytomètre, calculez le nombre de cellules et procédez à la concentration finale de deux fois 10 à cinq cellules par millilitre. Versez lentement deux millilitres de PBS dans le microcanal moyen de puce PDMS codé et stérilisé au collagène, puis jetez-le à l’aide d’une seringue de deux millilitres.Versez lentement deux millilitres de deux fois 10 à la suspension de cellules musculaires lisses de cinq cellules par millilitres dans le microcanal multimédia de la puce PDMS. Ensuite, fermez le leurre à l’entrée et à la sortie de la puce PDMS. Placez la puce PDMS dans un incubateur, réglé à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une journée.Après l’incubation, lorsque les cellules sont fixées à la membrane PDMS dans la puce PDMS, connectez la sortie du microcanal d’air sur la puce PDMS au système de contrôleur de vide. Une forme cellulaire normale allongée sera observée au microscope lorsque la cellule est attachée. Contraste avec les cellules rondes suspendues.Allumez l’électrovanne et la pompe à vide. Ouvrez le régulateur de vide et ajustez le niveau de pression en fonction des contraintes. Ensuite, placez les puces PDMS et un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.Préparez plusieurs électrovannes, filtres à vide, régulateurs de vide, une pompe à vide, une pompe péristaltique et un API contrôlant l’électrovanne. Programmez le contrôleur PLC et réglez l’intervalle de temps d’arrêt à un hertz. Connectez les électrovannes au contrôleur programmé.Connectez l’entrée de la pompe à vide aux filtres à vide, puis connectez la sortie des filtres à vide aux régulateurs de vide. Connectez la sortie des régulateurs de vide aux électrovannes. Et enfin, connectez la sortie des électrovannes aux sorties des microcanaux d’air des puces PDMS.Connectez la sortie de la pompe péristaltique à l’entrée du microcanal moyen de la puce PDMS et l’entrée de la pompe péristaltique à la sortie de la puce PDMS à microcanal moyen pour le remplacement du milieu de culture et la manipulation des médicaments. Ajustez l’amplitude de la déformation par le régulateur et la fréquence de déformation par le microcontrôleur. La viabilité de la lignée cellulaire de muscle lisse aortique humain, CRL 1990, dans la puce PDMS, a été estimée à l’aide d’un test vivant et mort les troisième et cinquième jours de culture cellulaire.La viabilité cellulaire a été jugée supérieure à 90% le troisième jour et le cinquième jour. La coloration du cytosquelette F-actine de CRL 1990, dans la puce PDMS, a montré une morphologie cellulaire normale et des cellules alignées perpendiculairement à la souche après un étirement de 24 heures. L’immunofluorescence des marqueurs contractiles SM22 et CNN1 était plus élevée dans des conditions de déformation par rapport aux conditions statiques.En outre, les gènes SM22 et CNN1 ont été régulés à la hausse dans des conditions de tension des cellules musculaires lisses. La coloration par F-actine du BAV et du TAV, l’anévrisme de l’aorte thoracique et la dissection des cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires dérivées du patient, ont montré une morphologie cellulaire normale et des cellules alignées perpendiculairement à la direction de la souche après un étirement de 24 heures. La fluorescence SM22 et CNN1 dans l’anévrisme et la dissection de l’aorte thoracique BAVTAAD et TAV était plus élevée dans des conditions de souche que dans des conditions statiques.Semblable aux niveaux d’expression génique de SM22 et CNN1, qui ont également été régulés à la hausse dans des conditions de souche par rapport à des conditions statiques. Une attention particulière doit être accordée au principe de stérilité lors de l’isolement du HASMC primaire. Une fois que les laboratoires PDMS et les membranes ont été traités avec du plasma, les surfaces ne doivent pas être souillées.Sur la base de ce protocole, les cellules endothéliales peuvent être co-cultivées avec des cellules musculaires lisses et le stress pur peut être donné aux cellules avec une contrainte cyclique pour simuler davantage plus de forces mécaniques.

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