Name: construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00
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Die Autoren bestätigen, dass diese Arbeit durch Zuschüsse der Science and Technology Commission der Stadtverwaltung Shanghai (20ZR1411700), der National Natural Science Foundation of China (81771971) und des Shanghai Sailing Program (22YF1406600) unterstützt wurde.

Menschliche Aortenproben wurden für die primäre HASMC-Isolierung unter Genehmigung des Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortenproben wurden von Patienten entnommen, die sich einer aufsteigenden Aortenoperation im Zhongshan Hospital der Fudan-Universität unterzogen. Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
1. Primäre Isolierung der glatten Muskelmuskulatur des Menschen
<ol><li>...

<ol>
	<li>Olsson, C., Thelin, S., St&#229;hle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection:+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14,000+cases+from+1987+to+2002.">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li><li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+remodeling:+lessons+from+genetic+diseases.">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li><li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro.">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP/TAZ+signaling+pathway.">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li><li>Fabre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+a+manuscript+series+on+the+characterization+and+use+of+microphysiological+systems+(MPS)+in+pharmaceutical+safety+and+ADME+applications.">Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications.</a> Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).</li><li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans?+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection.">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li><li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro.">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li><li>Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+liver+models+on+a+microplatform:+well-defined+culture,+engineering+of+liver+tissue+and+liver-on-a-chip.">3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip.</a> Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-on-a-chip+based+on+stem+cell+biology.">Heart-on-a-chip based on stem cell biology.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).</li><li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity.">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).</li><li>Perestrelo, A. R., &#193;guas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ/body-on-a-chip+devices+at+the+convergence+of+biology+and+microengineering.">Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cancer-on-a-chip+for+drug+screening.">Construction of cancer-on-a-chip for drug screening.</a> Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+organ-on-a-chip+to+improve+cell+capture+efficiency.">Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency.</a> International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).</li><li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting.">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).</li><li>Mohammed, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+devices:+improvement+of+surface+quality+of+CO2+laser+machined+poly+(methylmethacrylate)+polymer.">Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).</li><li>Tsao, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+microfluidics:+Simple,+low-cost+fabrication+process+bridging+academic+lab+research+to+commercialized+production.">Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production.</a> Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).</li><li>Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+electrochemiluminescence+(ECL)+in+and+for+microfluidic+analytical+devices.">A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).</li><li>Stefanadis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-diameter+relation+of+the+human+aorta.+A+new+method+of+determination+by+the+application+of+a+special+ultrasonic+dimension+catheter.">Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter.</a> Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).</li><li>Williams, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+vascular+smooth+muscle+cell+function.">Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function.</a> Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).</li><li>Abudupataer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta+smooth+muscle-on-a-chip+reveals+impaired+mitochondrial+dynamics+as+a+therapeutic+target+for+aortic+aneurysm+in+bicuspid+aortic+valve+disease.">Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease.</a> eLife. 10, 69310 (2021).</li><li>Poussin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+human+microvessel-on-a-chip+model+for+studying+monocyte-to-endothelium+adhesion+under+flow+-+application+in+systems+toxicology.">3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology.</a> Altex. 1, 47-63 (2020).</li><li>Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artery-on-a-chip+platform+for+automated,+multimodal+assessment+of+cerebral+blood+vessel+structure+and+function.">Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function.</a> Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).</li></ol>

Mit der rasanten Entwicklung der mikrofluidischen Technologie sind in den letzten Jahren OOC-Modelle entstanden, die die biologische Funktion und Struktur eines oder mehrerer Organe in vitro für Anwendungen in Biologie, Medizin und Pharmakologie replizieren können15. OOC kann Schlüsselfunktionen der menschlichen physiologischen Mikroumgebung simulieren, die für die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Förderung der präklinischen Arzneimitteltranslation unerlässlich sind<su...

Thoraxaortenaneurysma und -dissektion (TAAD) ist eine lokalisierte Dilatation oder Delaminierung der Aortenwand, die mit hoher Morbidität und Mortalität einhergeht1. Menschliche glatte Aortenmuskelzellen (HASMCs) spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von TAAD. HASMCs sind keine terminalen differenzierten Zellen, und HASMCs behalten eine hohe Plastizität, so dass sie den Phänotyp als Reaktion auf verschiedene Reize wechseln können2. HASMCs werden hauptsächlich in vivo rhythmischen Zugbelastungen ausgesetzt, was einer der Schlüsselfaktoren ist, die morphologische Veränderungen, Differenzierung und physiologische Funktionen der glatten Muskulatur regulieren 3,4. Daher kann die Rolle der zyklischen Belastung bei der Untersuchung von HASMCs nicht ignoriert werden. Herkömmliche 2D-Zellkulturen können jedoch die biomechanische Stimulation zyklischer Belastungen, die HASMCs in vivo erfahren, nicht replizieren. Darüber hinaus ist die Konstruktion eines Tier-TAAD-Modells für einige Arten von TAAD nicht geeignet, wie z. B. BICUSPIDAL-Aortenklappe (BAV)-bezogene TAAD. Darüber hinaus kann die Artenlücke zwischen klinischen Humanstudien und Tierversuchen nicht ignoriert werden. Es behindert die pharmazeutische Übersetzung in der klinischen Praxis. Daher besteht ein dringender Bedarf an komplexeren und physiologischen Systemen, um die biomechanische Umgebung in vivo bei der Erforschung von Aortenerkrankungen zu simulieren.
Tierversuche, die in der biomedizinischen Forschung und Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden, sind kostspielig, zeitaufwendig und ethisch fragwürdig. Darüber hinaus können die Ergebnisse aus Tierstudien häufig nicht die Ergebnisse vorhersagen, die in klinischen Studien am Menschen erzielt wurden 5,6. Der Mangel an präklinischen Modellen am Menschen und die hohe Ausfallrate in klinischen Studien haben zu wenigen wirksamen Medikamenten für die Klinik geführt, was die Gesundheitskosten erhöht hat7. Daher ist es dringend notwendig, andere experimentelle Modelle zu finden, die Tiermodelle ergänzen. Mikrofabrikation und mikrofluidische Techniken haben sich in den letzten Jahren stark entwickelt und bieten neuartige Techniken zur Etablierung von Organoid-on-a-Chip-Modellen, die die Nachteile traditioneller 2D-Zellkulturtechniken beheben und ein realistischeres, kostengünstigeres und effizienteres In-vitro-Modell für physiologische Studien und Arzneimittelentwicklung etablieren. Mit Hilfe mikrofluidischer Geräte werden Organe-on-Chips etabliert, um lebende Zellen in mikrometergroßen Kammern mit unterschiedlichen Reizen zu kultivieren, um die Schlüsselfunktionen eines Gewebes oder Organs zu replizieren. Das System besteht aus einzelnen oder mehreren mikrofluidischen Mikrokanälen, wobei entweder eine Zellart in einer perfundierten Kammer kultiviert wird, die Funktionen eines Gewebetyps repliziert, oder verschiedene Zelltypen, die auf porösen Membranen kultiviert werden, um Grenzflächen zwischen verschiedenen Geweben nachzubilden. Mikrofluidische Organoide in Kombination mit patientenbasierten Zellen haben den einzigartigen Vorteil, den großen Artenunterschied zwischen Maus- und Humankrankheitsmodellen zu überbrücken und die Nachteile der traditionellen 2D-Zellkultur für die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Wirkstoffforschung zu überwinden. Mit der rasanten Entwicklung der Mikrofluidik in den letzten Jahren haben Forscher die Nützlichkeit von In-vitro-Organ-on-a-Chip (OOC)-Modellen erkannt, die komplexe biologische In-vivo-Parameter replizieren8. Diese mikrofluidischen Organoide simulieren biomechanische In-vitro-Umgebungen wie zyklische Dehnung, Scherspannung und Flüssigkeitsdruck und bieten eine dreidimensionale (3D) Zellkulturumgebung. Bis heute wurden mehrere OOC-Modelle etabliert, um biomechanische Reize in Organen wie Lunge9, Niere 10, Leber11, Darm12 und Herz13 zu simulieren, aber diese wurden nicht weit verbreitet auf die Untersuchung menschlicher Aortenerkrankungen angewendet.
In dieser Studie präsentieren wir ein humanes Organ-on-a-Chip-Modell (HASMC-OOC) für glatte Aortenmuskelzellen, das die biomimetischen mechanischen Kräfte und Rhythmen steuern kann, die auf von TAAD-Patienten abgeleitete primäre HASMCs angewendet werden. Der Chip besteht aus dreischichtigen, dicken Platten aus Polydimethylsiloxan (PDMS), die mit Kanälen geätzt sind, und zwei kommerzialisierten hochflexiblen PDMS-Membranen. HASMCs werden auf den PDMS-Membranen kultiviert. Der Kanal in der Mitte des Chips ist mit einem Kulturmedium für die Zellkultur gefüllt. Die oberen und unteren Kanäle des Chips sind mit einem Vakuumdruckversorgungssystem verbunden, das den Rhythmus und die Frequenz der mechanischen Zugdehnung der PDMS-Membranen steuern kann. Rhythmische Belastungen, denen HASMCs ausgesetzt sind, können in HASMC-OOC simuliert werden, wodurch die biomechanische Mikroumgebung von Gewebe oder Organen repliziert wird, die mit herkömmlichen 2D-Kultursystemen nicht funktionell erreichbar ist. Mit dem Vorteil der hochauflösenden Echtzeit-Bildgebung und der biomechanischen Mikroumgebung können die biochemischen, genetischen und metabolischen Aktivitäten lebender Zellen für Gewebeentwicklung, Organphysiologie, Krankheitsätiologie, molekulare Mechanismen und Biomarkeridentifizierung, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Aortenerkrankungen untersucht werden. In Kombination mit gewebespezifischen und Patientenzellen kann dieses System für Medikamentenscreenings, personalisierte Medizin und Toxizitätstests eingesetzt werden. Dieses HASMC-OOC-Modell bietet eine neuartige In-vitro-Plattform zur Untersuchung der Pathogenese der Aortenerkrankung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td>Used for cell immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0408</td>
			<td>Antibodies used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST025-20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium AM/PI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Ab46794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flexible 
			PDMS membrane</td>
			<td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td>
			<td>KYQ-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoses</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>96410</td>
			<td>1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human aortic smooth 
			muscle cell line CRL1999</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Lot Number:70019189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Imagej.net/fiji/downloads</td>
			<td>Free Download: https://fiji.sc</td>
			<td>Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ensures that the temperature, 
			humidity, and light exposure is 
			exactly the same throughout 
			experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>RH-M016</td>
			<td>Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse collagen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma&#160;</td>
			<td>Changzhou Hongming Instrument</td>
			<td>HM-Plasma5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>30-0138A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0221A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458-100ml</td>
			<td>Antibiodics used to prevent bacterial 
			contamination of cells during culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>F01A-STP-B046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC controller</td>
			<td>Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory</td>
			<td>BR010-11T8X2M</td>
			<td>The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMCM</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>Cat 1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>VQZ300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST795</td>
			<td>To penetrate cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filter</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>ZFC5-6</td>
			<td>Official website address: https://www.smc.com.cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>KVP15-KL-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum regulator</td>
			<td>AirTAC</td>
			<td>GVR-200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Name</td>
			<td>Forward (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td>Reverse (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td>
			<td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td>
			<td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall

Konventionelle zweidimensionale Zellkulturtechniken und Tiermodelle wurden bei der Untersuchung des menschlichen Thoraxaortenaneurysmas und der Dissektion (TAAD) verwendet. Menschliche TAAD kann jedoch manchmal nicht durch Tiermodelle charakterisiert werden. Es gibt eine offensichtliche Artenlücke zwischen klinischen Studien am Menschen und Tierversuchen, die die Entdeckung therapeutischer Medikamente behindern kann. Im Gegensatz dazu ist das konventionelle Zellkulturmodell nicht in der Lage, biomechanische Reize in vivo zu simulieren. Zu diesem Zweck haben sich Mikrofabrikations- und mikrofluidische Techniken in den letzten Jahren stark weiterentwickelt und bieten neuartige Techniken zur Etablierung von Organoid-on-a-Chip-Modellen, die die biomechanische Mikroumgebung nachbilden. In dieser Studie wurde ein humanes Organ-on-a-Chip-Modell (HASMC-OOC) entwickelt, um die pathophysiologischen Parameter der Aortenbiomechanik zu simulieren, einschließlich der Amplitude und Häufigkeit der zyklischen Belastung durch menschliche glatte Aortenmuskelzellen (HASMCs), die eine wichtige Rolle bei TAAD spielen. In diesem Modell wurde die Morphologie der HASMCs länglich, senkrecht zur Dehnungsrichtung ausgerichtet und zeigte unter Dehnungsbedingungen einen kontraktileren Phänotyp als unter statischen konventionellen Bedingungen. Dies stimmte mit der Zellorientierung und dem Phänotyp in nativen menschlichen Aortenwänden überein. Darüber hinaus haben wir unter Verwendung von bikuspidalen Aortenklappen-bezogenen TAAD (BAV-TAAD) und Trikuspidal-Aortenklappen-bezogenen TAAD (TAV-TAAD) patientenabgeleiteten primären HASMCs BAV-TAAD- und TAV-TAAD-Krankheitsmodelle etabliert, die HASMC-Eigenschaften in TAAD replizieren. Das HASMC-OOC-Modell bietet eine neuartige In-vitro-Plattform , die Tiermodelle ergänzt, um die Pathogenese von TAAD weiter zu erforschen und therapeutische Ziele zu entdecken.

Das HASMC-OOC-Modell besteht aus einem Vakuumsteuerungssystem, einem Umlaufsystem und PDMS-Chips sowie dem schematischen Aufbau des HASMC-OOC-Modells (Abbildung 1). Die Vakuumsteuerung besteht aus einer Vakuumpumpe, Magnetventilen und einer SPS-Steuerung. Als Kreislaufsystem wurde eine Schlauchpumpe verwendet, um das Zellkulturmedium aufzufrischen und Medikamente hinzuzufügen. Der PDMS-Chip bestand aus zwei Vakuumkammern und einer mittleren Kammer, die mit SMCM für das Zellwachstum gefüll...

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Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Hier haben wir ein Organ-on-a-Chip-Modell für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta entwickelt, um die in vivo biomechanische Belastung von glatten Muskelzellen in der menschlichen Aortenwand zu replizieren.

Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Dieses Modell stimuliert biomechanische Reize, die glatte Muskelzellen in der menschlichen Aorta erfahren. In Kombination mit Patientenzellen kann dieses System für das Arzneimittelscreening und die personalisierte Medizin von Aortenerkrankungen verwendet werden. Dieses Modell kann die bloßen mechanischen Parameter der glatten Muskelzellen in der menschlichen Aorta nachahmen und präzise steuern, was eine neuartige In-vitro-Plattform für die Untersuchung und Pathogenese von Aortenerkrankungen bietet.Mieradilijiang Abudubat, ein Posterdoktor aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Beginnen Sie mit dem Waschen der rechten lateralen Region der aufsteigenden Aorta mit sterilen pbs, ein- oder zweimal. Entfernen Sie die Intima- und eine Adventitiaschicht des Gewebes mit zwei Augenzangen und behalten Sie die Medienschicht, um die Zellen zu ernten.Legen Sie die Medienschicht auf eine 10 Zentimeter große Schale und schneiden Sie sie in zwei bis drei Millimeter große Stücke. Dann fügen Sie fünf Milliliter SMCM mit 10% fbs und 1% Penicillin Streptomycin zu den Gewebeproben hinzu. Bewegen Sie das kleine Gewebe mit einer sterilen Pipette in die Kulturflasche und verteilen Sie das Gewebe gleichmäßig.Entsorgen Sie das Kulturmedium so weit wie möglich. Dann drehen Sie die Flasche auf den Kopf. Geben Sie zwei Milliliter SMCM in die invertierte Kulturflasche und legen Sie sie für ein bis zwei Stunden mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius in den Inkubator.Dann drehen Sie es langsam auf die rechte Seite und fügen Sie weitere zwei Milliliter SMCM hinzu. Nach fünf bis sieben Tagen Inkubation tauschen Sie das SMCM durch vier Milliliter frisches SMCM aus. Verwerfen Sie das SMCM langsam und fügen Sie es hinzu, wenn Sie das Medium wechseln.Im Allgemeinen klettern sporadische glatte Muskelzellen in etwa zwei Wochen heraus. Transportieren Sie die Kulturflasche vorsichtig, wenn Sie sich zu einer Mikroskopstation bewegen. Andernfalls schwimmen die Gewebe und die Zellen wachsen langsam.Wenn die Zellen gewachsen sind, teilen Sie sie in zwei neue Kulturflaschen mit vier Milliliter frischem SMCM. Identifizieren Sie die Zellen durch eine Immunfluoreszenzanalyse von vier spezifischen Markern für glatte Muskelzellen. Um PDMS zu polymerisieren, fügen Sie den Härter oder die B-Komponente zur Basis oder zur A-Komponente hinzu und mischen Sie den Komplex fünf Minuten lang.Das Volumen hängt von der Notwendigkeit der Studie ab. Das vorbereitete PDMS-Gel für 30 bis 60 Minuten in einen Vakuumextraktionstank geben und den Druck unter negativen 0,8 Milli Pascal halten. Entwerfen Sie die Form mithilfe einer computergestützten Konstruktionssoftware.Maßgeschneiderte Herstellung der Formen der drei Schichten mit einer hochpräzisen numerischen Computer-Steuer-Graviermaschine. Nachdem Sie den Rahmen der Formen und die Mikrokanäle mit PMMA-Platten herausgeschnitten haben, kleben Sie sie auf eine andere Platte. Gießen Sie das vorbereitete PDMS-Gel auf eine entworfene Form.Dann bei 70 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden vernetzen. Ziehen Sie die vernetzten PDMS-Platten aus der Form ab und schneiden Sie die kommerzialisierten PDMS-Membranen in 100 Millimeter mal 40 Millimeter große Abschnitte. Stanzen Sie Löcher auf den drei PDMs-Platten mit einem Ein-Millimeter-Locher, um den Ein- und Auslass von Luft und mittleren Mikrokanälen auf dem PDMS-Chip zu machen.Behandeln Sie die drei vorbereiteten PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen fünf Minuten lang mit Sauerstoffplasma für die PDM-Oberflächenaktivierung. Stellen Sie die Raumluft auf Prozessgas, den Druck auf minus 100 Kilopascal, den Strom auf 180 bis 200 Milliampere-Pfeiler, die Spannung auf 200 Volt und die Verarbeitungszeit auf fünf Minuten ein. Verbinden Sie drei PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen unter einem stereoskopischen Mikroskop miteinander, so dass die oberste Schicht aus der Luftkanal-PDMS-Platte und dann aus der PDMS-Membran besteht.Der mittlere Kanal besteht aus der PDMS-Platte, dann der PDM-Membran und der unteren Schicht ist die Luftkanal-PDMS-Platte. Legen Sie den bestückten PDMS-Chip für eine Stunde in einen 70-Grad-Inkubator. Bereiten Sie mehrere einen Millimeter Innendurchmesser und drei Zentimeter lange Latexschläuche vor.Führen Sie einen Millimeter Außendurchmesser und eine einen Zentimeter lange Edelstahlnadel in ein Ende des vorbereiteten Schlauchs ein. Führen Sie dann einen Köder in das andere Ende des Schlauchs ein, um den Schlauch zu erzeugen, der mit den Luft- und Medienmikrokanälen des PDMS-Chips verbunden ist. Stecken Sie die vorbereiteten Röhrchen in die Aus- und Einlässe der Luft- und Medienmikrokanäle auf dem PDMS-Chip.Infusion von zwei Milliliter 80 Milliliter Mauskollagen in den mittleren Mikrokanal des PDMs-Chips mit einer Zwei-Milliliter-Spritze und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach der Inkubation das Kollagen mit einer Zwei-Milliliter-Spritze aus dem Kanal entfernen. Legen Sie die kollagencodierten PDMS-Chips über Nacht in einen 60-Grad-Inkubator.Legen Sie die PDMS-Chips für mehr als eine Stunde in einen UV-Sterilisator. Legen Sie die sterilisierten PDMS-Chips auf eine ultrareine Bank, um sich auf das Zellexperiment vorzubereiten. Kultur viermal 10 zu den fünf primären menschlichen glatten Aortenmuskelzellen von Patienten, die SMCM mit 2% FBS und 1% Penicillin Streptomycin in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator verwenden, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.Wenn die Zelldichte der glatten Muskulatur 80% erreicht, verwerfen Sie die SMCM und waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PPS. Verdauen Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,25% Tripsin für zwei Minuten und zentrifugieren Sie bei 100 RCF für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter frischem SMCM.Verwenden Sie acht Milliliter SMCM, um die Zellen auf einer 10 Zentimeter großen Kulturschale zu kultivieren. Berechnen Sie mit einem Zytometer die Zellzahl und fahren Sie mit der Endkonzentration von zwei mal 10 bis zu den fünf Zellen pro Milliliter fort. Gießen Sie langsam zwei Milliliter PBS in den kollagencodierten und sterilisierten PDMS-Chip-Mikrokanal und entsorgen Sie ihn später mit einer Zwei-Milliliter-Spritze.Gießen Sie langsam zwei Milliliter von zwei mal 10 zu den fünf Zellen pro Milliliter glatter Muskelzellsuspension in den Medienmikrokanal des PDMS-Chips. Schließen Sie dann den Köder am Ein- und Ausgang des PDMS-Chips. Legen Sie den PDMS-Chip in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für einen Tag eingestellt ist.Nach der Inkubation, wenn die Zellen an der PDMS-Membran im PDMS-Chip befestigt sind, verbinden Sie den Auslass des Luftmikrokanals auf dem PDMS-Chip mit dem Vakuum-Controller-System. Eine längliche normale Zellform wird unter dem Mikroskop gesehen, wenn die Zelle befestigt ist. Im Gegensatz zu den aufgehängten runden Zellen.Schalten Sie das Magnetventil und die Vakuumpumpe ein. Öffnen Sie den Vakuumregler und passen Sie das Druckniveau je nach Beanspruchung an. Dann legen Sie die PDMS-Chips und einen Inkubator auf 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden.Bereiten Sie mehrere Magnetventile, Vakuumfilter, Vakuumregler, eine Vakuumpumpe, eine Schlauchpumpe und eine SPS vor, die das Magnetventil steuert. Programmieren Sie die SPS-Steuerung und stellen Sie das Ein-Aus-Zeitintervall auf ein Hertz ein. Schließen Sie die Magnetventile an die programmierte Steuerung an.Verbinden Sie den Einlass der Vakuumpumpe mit den Vakuumfiltern und dann den Ausgang der Vakuumfilter mit den Vakuumreglern. Schließen Sie den Ausgang der Vakuumregler an Magnetventile an. Und schließlich verbinden Sie den Ausgang der Magnetventile mit den Auslässen der Luftmikrokanäle der PDMS-Chips.Verbinden Sie den Ausgang der Schlauchpumpe mit dem Einlass des mittleren Mikrokanals des PDMS-Chips und den Einlass der Schlauchpumpe mit dem Ausgang des mittleren Mikrokanal-PDMS-Chips für den Austausch des Kulturmediums und die Handhabung von Medikamenten. Stellen Sie die Amplitude der Dehnung durch den Regler und die Dehnungsfrequenz durch den Mikrocontroller ein. Die Lebensfähigkeit der menschlichen Zelllinie der glatten Aortenmuskulatur, CRL 1990, im PDMS-Chip wurde unter Verwendung eines Lebend- und Totentests am dritten und fünften Tag der Zellkultur geschätzt.Die Zelllebensfähigkeit wurde am dritten und fünften Tag über 90% gefunden. Die F-Aktin-Färbung des Zytoskeletts von CRL 1990 im PDMS-Chip zeigte eine normale Zellmorphologie und Zellen, die nach 24 Stunden Dehnung senkrecht zum Stamm ausgerichtet waren. Die Immunfluoreszenz der kontraktilen Marker SM22 und CNN1 war unter Belastungsbedingungen höher als unter statischen Bedingungen.Auch die SM22- und CNN1-Gene wurden unter Belastungsbedingungen von glatten Muskelzellen hochreguliert. Die F-Aktin-Färbung von BAV und TAV, das thorakale Aortenaneurysma und die Dissektion von patientenabgeleiteten primären menschlichen glatten Aortenmuskelzellen, zeigten eine normale Zellmorphologie und Zellen, die nach 24 Stunden Dehnung senkrecht zur Dehnungsrichtung ausgerichtet waren. Die SM22- und CNN1-Fluoreszenz in BAVTAAD und TAV thorakales Aortenaneurysma und Dissektion waren unter Belastungsbedingungen höher als unter statischen Bedingungen.Ähnlich wie die Genexpressionsniveaus von SM22 und CNN1, die unter Stammbedingungen im Vergleich zu statischen Bedingungen ebenfalls hochreguliert wurden. Bei der Isolierung von primärem HASMC sollte auf das Prinzip der Sterilität geachtet werden. Nachdem die PDMS-Labore und die Membranen mit Plasma behandelt wurden, sollten die Oberflächen nicht verschmutzt werden.Basierend auf diesem Protokoll können Endothelzellen mit glatten Muskelzellen kokultiviert werden, und die schiere Belastung kann den Zellen mit zyklischer Belastung gegeben werden, um mehr mechanische Kräfte weiter zu simulieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

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Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

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