Name: construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall at JoVE.com

Forfatterne erkjenner at dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20ZR1411700), National Natural Science Foundation of China (81771971) og Shanghai Sailing Program (22YF1406600).

Menneskelige aortaprøver ble brukt til primær HASMC-isolasjon under godkjenning av Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortaprøver ble samlet inn fra pasienter som gjennomgikk stigende aortaoperasjon ved Zhongshan Hospital, Fudan University. Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra alle pasientene før medvirkning.
1. Primær human aorta glatt muskelcelle isolasjon
<ol><li>Vask høyre laterale område av den stigende aorta med ...

<ol>
	<li>Olsson, C., Thelin, S., St&#229;hle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection:+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14,000+cases+from+1987+to+2002.">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li><li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+remodeling:+lessons+from+genetic+diseases.">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li><li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro.">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP/TAZ+signaling+pathway.">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li><li>Fabre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+a+manuscript+series+on+the+characterization+and+use+of+microphysiological+systems+(MPS)+in+pharmaceutical+safety+and+ADME+applications.">Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications.</a> Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).</li><li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans?+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection.">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li><li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro.">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li><li>Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+liver+models+on+a+microplatform:+well-defined+culture,+engineering+of+liver+tissue+and+liver-on-a-chip.">3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip.</a> Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-on-a-chip+based+on+stem+cell+biology.">Heart-on-a-chip based on stem cell biology.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).</li><li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity.">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).</li><li>Perestrelo, A. R., &#193;guas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ/body-on-a-chip+devices+at+the+convergence+of+biology+and+microengineering.">Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cancer-on-a-chip+for+drug+screening.">Construction of cancer-on-a-chip for drug screening.</a> Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+organ-on-a-chip+to+improve+cell+capture+efficiency.">Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency.</a> International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).</li><li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting.">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).</li><li>Mohammed, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+devices:+improvement+of+surface+quality+of+CO2+laser+machined+poly+(methylmethacrylate)+polymer.">Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).</li><li>Tsao, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+microfluidics:+Simple,+low-cost+fabrication+process+bridging+academic+lab+research+to+commercialized+production.">Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production.</a> Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).</li><li>Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+electrochemiluminescence+(ECL)+in+and+for+microfluidic+analytical+devices.">A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).</li><li>Stefanadis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-diameter+relation+of+the+human+aorta.+A+new+method+of+determination+by+the+application+of+a+special+ultrasonic+dimension+catheter.">Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter.</a> Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).</li><li>Williams, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+vascular+smooth+muscle+cell+function.">Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function.</a> Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).</li><li>Abudupataer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta+smooth+muscle-on-a-chip+reveals+impaired+mitochondrial+dynamics+as+a+therapeutic+target+for+aortic+aneurysm+in+bicuspid+aortic+valve+disease.">Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease.</a> eLife. 10, 69310 (2021).</li><li>Poussin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+human+microvessel-on-a-chip+model+for+studying+monocyte-to-endothelium+adhesion+under+flow+-+application+in+systems+toxicology.">3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology.</a> Altex. 1, 47-63 (2020).</li><li>Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artery-on-a-chip+platform+for+automated,+multimodal+assessment+of+cerebral+blood+vessel+structure+and+function.">Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function.</a> Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).</li></ol>

Med den raske utviklingen av mikrofluidisk teknologi har OOC-modeller som kan replikere den biologiske funksjonen og strukturen til ett eller flere organer in vitro, dukket opp de siste årene for applikasjoner innen biologi, medisin og farmakologi15. OOC kan simulere nøkkelfunksjoner i det menneskelige fysiologiske mikromiljøet, avgjørende for å utforske sykdomsmekanismer og fremme preklinisk legemiddeloversettelse 8,16. Selv...

Thorax aortaaneurisme og disseksjon (TAAD) er en lokalisert dilatasjon eller delaminering av aortaveggen som er forbundet med høy morbiditet og dødelighet1. Humane aorta glatte muskelceller (HASMCs) spiller en viktig rolle i patogenesen av TAAD. HASMCs er ikke terminalt differensierte celler, og HASMCs beholder høy plastisitet, slik at de kan bytte fenotyper som svar på forskjellige stimuli2. HASMCs blir hovedsakelig utsatt for rytmisk strekkbelastning in vivo, og dette er en av nøkkelfaktorene som regulerer morfologiske endringer i glatt muskulatur, differensiering og fysiologiske funksjoner 3,4. Derfor kan rollen som syklisk belastning i studien av HASMCs ikke ignoreres. Imidlertid kan konvensjonelle 2D-cellekulturer ikke replikere den biomekaniske stimuleringen av syklisk stamme opplevd av HASMCs in vivo. I tillegg er konstruksjonen av en dyr TAAD-modell ikke egnet for noen typer TAAD, for eksempel bicuspid aortaklaff (BAV)-relatert TAAD. Videre kan artsgapet mellom kliniske menneskelige studier og dyreforsøk ikke ignoreres. Det hindrer farmasøytisk oversettelse i klinisk praksis. Dermed er det et presserende behov for mer komplekse og fysiologiske systemer for å simulere det in vivo biomekaniske miljøet i forskningen av aortasykdommer.
Dyreforsøk som brukes i biomedisinsk forskning og medisinutvikling er kostbare, tidkrevende og etisk tvilsomme. I tillegg unnlater resultatene fra dyreforsøk ofte å forutsi resultatene oppnådd i kliniske studierpå mennesker 5,6. Mangelen på menneskelige prekliniske modeller og høy feilrate i kliniske studier har resultert i få effektive medisiner for klinikken, noe som har økt helsekostnadene7. Dermed er det presserende å finne andre eksperimentelle modeller for å utfylle dyremodeller. Mikrofabrikasjon og mikrofluidiske teknikker har utviklet seg sterkt de siste årene, og gir nye teknikker for å etablere organoider-on-a-chip-modeller som avhjelper ulempene ved tradisjonelle 2D-cellekulturteknikker og etablerer en mer realistisk, rimelig og effektiv in vitro-modell for fysiologiske studier og stoffutvikling. Ved hjelp av mikrofluidiske enheter etableres organer-på-chips for å dyrke levende celler i mikrometerstore kamre med forskjellige stimuli for å replikere nøkkelfunksjonene til et vev eller organ. Systemet består av enkle eller flere mikrofluidiske mikrokanaler, med enten en type celle dyrket i et perfundert kammerreplikerende funksjoner av en vevstype eller forskjellige celletyper dyrket på porøse membraner for å gjenskape grensesnitt mellom forskjellige vev. Mikrofluidisk-baserte organoider kombinert med pasientavledede celler har den unike fordelen av å bygge bro over den store artsforskjellen mellom mus og menneskelige sykdomsmodeller og overvinne ulempene ved tradisjonell 2D-cellekultur for sykdomsmekanismeforskning og narkotikaforskning. Med den raske utviklingen av mikrofluidikk de siste årene har forskere innsett nytten av in vitro organ-on-a-chip (OOC) modeller som replikerer komplekse in vivo biologiske parametere8. Disse mikrofluidiske organoider simulerer in vitro biomekaniske miljøer, for eksempel syklisk belastning, skjærspenning og flytende trykk, og gir et tredimensjonalt (3D) cellekulturmiljø. Til dags dato har flere OOC-modeller blitt etablert for å simulere biomekaniske stimuli i organer som lunge9, nyre 10, lever 11, tarm12 og hjerte 13, men disse har ikke blitt mye brukt til studiet av human aortasykdom.
I denne studien presenterer vi en human aorta glatt muskelcelleorgan-on-a-chip (HASMC-OOC) modell som kan kontrollere de biomimetiske mekaniske kreftene og rytmene som brukes på TAAD pasientavledede primære HASMCs. Brikken består av trelags tykke plater av polydimetylsiloksan (PDMS) etset med kanaler og to kommersialiserte svært fleksible PDMS-membraner. HASMCs dyrkes på PDMS-membranene. Kanalen i midten av brikken er fylt med et kulturmedium for cellekultur. Topp- og bunnkanalene til brikken er koblet til et vakuumtrykkforsyningssystem som kan kontrollere rytmen og frekvensen av mekanisk strekkbelastning av PDMS-membranene. Rytmisk belastning opplevd av HASMCs kan simuleres i HASMC-OOC, replikerer det biomekaniske mikromiljøet av vev eller organ som ikke er funksjonelt oppnåelig med konvensjonelle 2D-kultursystemer. Med fordelen av høyoppløselig, sanntidsavbildning og biomekanisk mikromiljø, kan de biokjemiske, genetiske og metabolske aktivitetene til levende celler studeres for vevsutvikling, organfysiologi, sykdomsetiologi, molekylære mekanismer og biomarkøridentifikasjon, kardiovaskulær sykdom og aortasykdom. Kombinert med vevsspesifikke og pasientceller, kan dette systemet brukes til narkotikascreening, personlig medisin og toksisitetstesting. Denne HASMC-OOC-modellen gir en ny in vitro-plattform for å studere patogenesen av aortasykdommen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td>Used for cell immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0408</td>
			<td>Antibodies used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST025-20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium AM/PI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Ab46794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flexible 
			PDMS membrane</td>
			<td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td>
			<td>KYQ-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoses</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>96410</td>
			<td>1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human aortic smooth 
			muscle cell line CRL1999</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Lot Number:70019189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Imagej.net/fiji/downloads</td>
			<td>Free Download: https://fiji.sc</td>
			<td>Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ensures that the temperature, 
			humidity, and light exposure is 
			exactly the same throughout 
			experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>RH-M016</td>
			<td>Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse collagen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma&#160;</td>
			<td>Changzhou Hongming Instrument</td>
			<td>HM-Plasma5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>30-0138A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0221A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458-100ml</td>
			<td>Antibiodics used to prevent bacterial 
			contamination of cells during culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>F01A-STP-B046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC controller</td>
			<td>Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory</td>
			<td>BR010-11T8X2M</td>
			<td>The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMCM</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>Cat 1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>VQZ300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST795</td>
			<td>To penetrate cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filter</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>ZFC5-6</td>
			<td>Official website address: https://www.smc.com.cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>KVP15-KL-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum regulator</td>
			<td>AirTAC</td>
			<td>GVR-200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Name</td>
			<td>Forward (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td>Reverse (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td>
			<td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td>
			<td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall

Konvensjonelle todimensjonale cellekulturteknikker og dyremodeller har blitt brukt i studiet av human thorax aortaaneurisme og disseksjon (TAAD). Imidlertid kan menneskelig TAAD noen ganger ikke karakteriseres av dyremodeller. Det er et tilsynelatende artsgap mellom kliniske menneskelige studier og dyreforsøk som kan hindre oppdagelsen av terapeutiske legemidler. I motsetning til dette er den konvensjonelle cellekulturmodellen ikke i stand til å simulere in vivo biomekaniske stimuli. For dette formål har mikrofabrikasjon og mikrofluidiske teknikker utviklet seg sterkt de siste årene, og gir nye teknikker for å etablere organoider-on-a-chip-modeller som replikerer det biomekaniske mikromiljøet. I denne studien ble en human aorta glatt muskelcelleorgan-on-a-chip (HASMC-OOC) -modell utviklet for å simulere de patofysiologiske parametrene for aortabiomekanikk, inkludert amplituden og frekvensen av syklisk belastning opplevd av humane aorta glatte muskelceller (HASMCs) som spiller en viktig rolle i TAAD. I denne modellen ble morfologien til HASMCs langstrakt i form, justert vinkelrett på belastningsretningen, og presenterte en mer kontraktil fenotype under belastningsforhold enn under statiske konvensjonelle forhold. Dette var i samsvar med celleorientering og fenotype i innfødte humane aortavegger. I tillegg, ved hjelp av bicuspid aortaklaff-relaterte TAAD (BAV-TAAD) og tricuspid aortaklaff-relaterte TAAD (TAV-TAAD) pasientavledede primære HASMCs, etablerte vi BAV-TAAD og TAV-TAAD sykdomsmodeller, som replikerer HASMC-egenskaper i TAAD. HASMC-OOC-modellen gir en ny in vitro-plattform som er komplementær til dyremodeller for videre å utforske patogenesen til TAAD og oppdage terapeutiske mål.

HASMC-OOC-modellen består av et vakuumkontrollsystem, et sirkulasjonssystem og PDMS-brikker, og den skjematiske utformingen av HASMC-OOC-modellen (figur 1). Vakuumkontrollsystemet består av en vakuumpumpe, magnetventiler og en PLC-regulator. For å fungere som sirkulasjonssystemet ble en peristaltisk pumpe brukt til å oppdatere cellekulturmediet og legge til medisiner. PDMS-brikken besto av to vakuumkamre og et midtkammer fylt med SMCM for cellevekst. I henhold til utformingen av sponstru...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall at JoVE.com

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Her utviklet vi en human aorta glatt muskelcelle organ-on-a-chip-modell for å replikere in vivo biomekanisk belastning av glatte muskelceller i den menneskelige aortaveggen.

Konstruksjon av en human aorta glatt muskelcelle organ-on-a-chip modell for rekapitulere biomekanisk belastning i aortaveggen

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Denne modellen stimulerer biomekaniske stimuli opplevd av glatte muskelceller i human aorta. Kombinert med pasienter avledet celler, kan dette systemet brukes til narkotika screening og personlig medisin av aortasykdommer. Denne modellen kan etterligne og nøyaktig kontrollere de nakne mekaniske parametrene til glatte muskelceller i human aorta, noe som gir en ny in vitro-plattform for studier og patogenese av aortasykdommer.Demonstrere prosedyren vil være Mieradilijiang Abudubat, en plakat lege fra vårt laboratorium. Begynn med å vaske høyre laterale område av den stigende aorta med sterile pbs, en eller to ganger. Fjern intima- og adventitia-lagene i vevet med to oftalmiske tang og behold medielaget for å høste cellene.Legg medielaget på en 10 centimeter tallerken og kutt den i to til tre millimeter stykker. Deretter tilsettes fem milliliter SMCM som inneholder 10% fbs og 1% penicillin streptomycin til vevsprøvene. Flytt det lille vevet inn i kulturflasken med en steril dropper, spre vevet jevnt.Kast kulturmediet så mye som mulig. Vend deretter flasken opp ned. Tilsett to milliliter SMCM i den inverterte kulturflasken og legg den i inkubatoren med 5% karbondioksid ved 37 grader Celsius i en til to timer.Snu den deretter sakte med høyre side opp og legg til ytterligere to milliliter SMCM. Etter fem til syv dager med inkubasjon, bytt SMCM med fire milliliter fersk SMCM. Kast sakte og legg til SMCM når du bytter medium.Vanligvis klatrer sporadiske glatte muskelceller ut på omtrent to uker. Transporter kulturflasken forsiktig når du flytter til en mikroskopstasjon. Ellers vil vevet flyte og cellene vil vokse sakte.Når cellene har vokst, del dem i to nye kulturflasker med fire milliliter fersk SMCM. Identifiser cellene gjennom en immunfluorescensanalyse av fire spesifikke markører for glatte muskelceller. For å polymerisere PDMS, tilsett herdemiddelet eller B-komponenten til basen eller A-komponenten og bland komplekset i fem minutter.Volumet vil avhenge av behovet for studien. Plasser den tilberedte PDMS-gelen i en vakuumekstraksjonstank i 30 til 60 minutter og hold trykket under negative 0,8 milli pascals. Bruk datamaskinstøttet designprogramvare, design formen.Tilpass formene til de tre lagene ved hjelp av en numerisk kontrollgraveringsmaskin med høy presisjon. Etter å ha skåret ut rammen av formene og mikrokanalene ved hjelp av PMMA-plater, lim dem på en annen plate. Hell den tilberedte PDMS-gelen på en designet form.Deretter kryssbinding ved 70 grader Celsius i en til to timer. Skrell av de tverrbundne PDMS-platene fra formen og skjær de kommersialiserte PDMS-membranene i 100 millimeter x 40 millimeter seksjoner. Slå hull på de tre PDM-platene ved hjelp av en en millimeter hullstanser for å lage innløp og utløp av luft og medium mikrokanaler på PDMS-brikken.Behandle de tre tilberedte PDMS-platene og to PDMS-membraner med oksygenplasma i fem minutter for PDMs overflateaktivering. Still romluften til å behandle gass, trykk til negative 100 kilopascal, strøm til 180 til 200 milliampbrygger, spenning til 200 volt og behandlingstiden til fem minutter. Lim tre PDMS-plater og to PDMS-membraner sammen under et stereoskopisk mikroskop, slik at topplaget består av luftkanalens PDMS-plate, deretter PDMS-membranen.Mediumkanalen består av PDMS-platen, deretter PDMs membran, og bunnlaget er luftkanalens PDMS-plate. Plasser den monterte PDMS-brikken i en 70 grader Celsius inkubator i en time. Forbered flere en millimeter indre diameter og tre centimeter lengde latex slanger.Sett inn en millimeter ytre diameter og en centimeter lang nål i rustfritt stål i den ene enden av den forberedte slangen. Sett deretter et lokke inn i den andre enden av slangen for å lage røret som er koblet til luften og de middels mikrokanalene til PDMS-brikken. Sett de forberedte rørene inn i uttakene og innløpene til luften og mediummikrokanalene på PDMS-brikken.Tilfør to milliliter 80 milligram per milliliter musekollagen i den mellomstore mikrokanalen til PDMs-brikken, ved hjelp av en to milliliter sprøyte, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Etter inkubering, fjern kollagenet fra kanalen med en to milliliter sprøyte. Plasser kollagenkodede PDMS-brikker i en 60 grader Celsius inkubator over natten.Plasser PDMS-brikkene i en UV-sterilisator i mer enn en time. Plasser de steriliserte PDMS-brikkene på en ultra ren benk som forberedelse til celleeksperimentet. Kultur fire ganger 10 til de fem primære humane aorta glatte muskelceller fra pasienter som bruker SMCM som inneholder 2% FBS og 1% penicillin streptomycin i en 5% karbondioksidinkubator, satt til 37 grader celsius.Når glatt muskel celle tetthet når 80%, kaste SMCM, og vaske cellene med to milliliter PPS. Fordøye cellene ved hjelp av en milliliter 0, 25% tripsin i to minutter og sentrifuge ved 100 RCF i fem minutter. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i en milliliter fersk SMCM.Bruk åtte milliliter SMCM til å dyrke cellene på en 10 centimeter kulturskål. Bruk et cytometer, beregne cellenummeret og fortsett med den endelige konsentrasjonen på to ganger 10 til de fem cellene per milliliter. Hell sakte to milliliter PBS i kollagenkodet og sterilisert PDMS-chip medium mikrokanal og kast senere ved hjelp av en to milliliter sprøyte.Hell sakte to milliliter to ganger 10 til de fem cellene per milliliter glatt muskelcellesuspensjon i mediemikrokanalen til PDMS-brikken. Lukk deretter lokket ved inngangen og utgangen av PDMS-brikken. Plasser PDMS-brikken i en inkubator, satt til 37 grader celsius med 5% karbondioksid i en dag.Etter inkubasjon, når cellene er festet til PDMS-membranen i PDMS-brikken, kobler du utløpet til luftmikrokanalen på PDMS-brikken til vakuumstyringssystemet. En langstrakt normal cellulær form vil bli sett under mikroskopet når cellen er festet. I kontrast til de suspenderte runde cellene.Slå på magnetventilen og vakuumpumpen. Åpne vakuumregulatoren og juster trykknivået avhengig av belastningene. Plasser deretter PDMS-brikkene og en inkubator satt til 37 grader celsius med 5% karbondioksid i 24 timer.Forbered flere magnetventiler, vakuumfiltre, vakuumregulatorer, en vakuumpumpe, en peristaltisk pumpe og en PLC som styrer magnetventilen. Programmer PLC-kontrolleren og sett av-tidsintervallet til en hertz. Koble magnetventilene til den programmerte styreenheten.Koble innløpet til vakuumpumpen til vakuumfiltrene, og koble deretter utløpet til vakuumfiltrene til vakuumregulatorene. Koble utløpet til vakuumregulatorene til magnetventiler. Og til slutt kobler du utløpet til magnetventilene til utløpene til luftmikrokanalene til PDMS-brikkene.Koble utløpet til den peristaltiske pumpen til innløpet til den mellomstore mikrokanalen til PDMS-brikken og innløpet til den peristaltiske pumpen til utløpet til PDMS-brikken med medium mikrokanal for utskifting av kulturmedium og legemiddelhåndtering. Juster amplituden til belastningen av regulatoren og belastningsfrekvensen av mikrokontrolleren. Levedyktigheten til den humane aorta glatte muskelcellelinjen, CRL 1990, i PDMS-brikken, ble estimert ved hjelp av en levende og død analyse på den tredje og femte dagen av cellekultur.Cellens levedyktighet ble funnet høyere enn 90% på dag tre og dag fem. Cytoskjelett F-aktinfarging av CRL 1990, i PDMS-brikken, viste normal cellemorfologi og celler justert vinkelrett på stammen etter strekking i 24 timer. Immunfluorescensen av kontraktile markørene SM22 og CNN1, var høyere under belastningsforhold sammenlignet med de statiske forholdene.SM22- og CNN1-genene ble også oppregulert i belastningsforhold av glatte muskelceller. F-aktinfarging av BAV og TAV, thorax aortaaneurisme og disseksjon av pasientavledede primære humane aorta glatte muskelceller, viste normal cellemorfologi og celler justert vinkelrett på belastningsretningen etter strekking i 24 timer. SM22- og CNN1-fluorescensen i BAVTAAD og TAV thorax aortaaneurisme og disseksjon var høyere under belastningsforhold enn under statiske forhold.I likhet med genuttrykksnivåene til SM22 og CNN1, som også ble oppregulert i belastningsforhold sammenlignet med statiske forhold. Det bør tas hensyn til sterilitetsprinsippet ved isolering av primær HASMC. Etter at PDMS-laboratoriene og membranene er behandlet med plasma, bør overflatene ikke tilsmusses.Basert på denne protokollen kan endotelceller dyrkes sammen med glatte muskelceller, og det rene stresset kan gis til cellene med syklisk belastning for ytterligere å simulere flere mekaniske krefter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Regissert Cellular Self-Assembly å dikte Cell-Avledet Tissue Rings for Biomekaniske Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Kultur Systems for Human Cell Culture: Human trophoblast Cells som en modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvåking veggen Mechanics Under Stent Deployment i en Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Bygging av en Flercellede 3D Stillas for levering av Lagdelte Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning av electro prosess for å gi tre unike miljøer for en Tri-lag<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust paracellular permeabilitet markør i en celle modell av Human Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...