Name: construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall at JoVE.com

Författarna erkänner att detta arbete stöddes av bidrag från Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20ZR1411700), National Natural Science Foundation of China (81771971) och Shanghai Sailing Program (22YF1406600).

Humana aortaprover användes för primär HASMC-isolering under godkännande av Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortaprover samlades in från patienter som genomgick stigande aortakirurgi vid Zhongshan Hospital, Fudan University. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter före deltagandet.
1. Primär human aorta glattmuskelcellisolering
<ol><li>Tvätta den högra sidoregionen av den stigande aortan med steril PBS, 1x-...

<ol>
	<li>Olsson, C., Thelin, S., St&#229;hle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection:+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14,000+cases+from+1987+to+2002.">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li><li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+remodeling:+lessons+from+genetic+diseases.">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li><li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro.">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP/TAZ+signaling+pathway.">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li><li>Fabre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+a+manuscript+series+on+the+characterization+and+use+of+microphysiological+systems+(MPS)+in+pharmaceutical+safety+and+ADME+applications.">Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications.</a> Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).</li><li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans?+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection.">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li><li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro.">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li><li>Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+liver+models+on+a+microplatform:+well-defined+culture,+engineering+of+liver+tissue+and+liver-on-a-chip.">3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip.</a> Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).</li><li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine.">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li><li>Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-on-a-chip+based+on+stem+cell+biology.">Heart-on-a-chip based on stem cell biology.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).</li><li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity.">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).</li><li>Perestrelo, A. R., &#193;guas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organ/body-on-a-chip+devices+at+the+convergence+of+biology+and+microengineering.">Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cancer-on-a-chip+for+drug+screening.">Construction of cancer-on-a-chip for drug screening.</a> Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+organ-on-a-chip+to+improve+cell+capture+efficiency.">Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency.</a> International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).</li><li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting.">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).</li><li>Mohammed, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+devices:+improvement+of+surface+quality+of+CO2+laser+machined+poly+(methylmethacrylate)+polymer.">Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).</li><li>Tsao, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+microfluidics:+Simple,+low-cost+fabrication+process+bridging+academic+lab+research+to+commercialized+production.">Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production.</a> Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).</li><li>Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+electrochemiluminescence+(ECL)+in+and+for+microfluidic+analytical+devices.">A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).</li><li>Stefanadis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-diameter+relation+of+the+human+aorta.+A+new+method+of+determination+by+the+application+of+a+special+ultrasonic+dimension+catheter.">Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter.</a> Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).</li><li>Williams, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+vascular+smooth+muscle+cell+function.">Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function.</a> Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).</li><li>Abudupataer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta+smooth+muscle-on-a-chip+reveals+impaired+mitochondrial+dynamics+as+a+therapeutic+target+for+aortic+aneurysm+in+bicuspid+aortic+valve+disease.">Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease.</a> eLife. 10, 69310 (2021).</li><li>Poussin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+human+microvessel-on-a-chip+model+for+studying+monocyte-to-endothelium+adhesion+under+flow+-+application+in+systems+toxicology.">3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology.</a> Altex. 1, 47-63 (2020).</li><li>Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artery-on-a-chip+platform+for+automated,+multimodal+assessment+of+cerebral+blood+vessel+structure+and+function.">Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function.</a> Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).</li></ol>

Med den snabba utvecklingen av mikrofluidisk teknik har OOC-modeller som kan replikera den biologiska funktionen och strukturen hos ett eller flera organ in vitro dykt upp de senaste åren för tillämpningar inom biologi, medicin och farmakologi15. OOC kan simulera nyckelfunktioner i den mänskliga fysiologiska mikromiljön, vilket är viktigt för att utforska sjukdomsmekanismer och främja preklinisk läkemedelsöversättning 8,16</s...

Thoraxaortaaneurysm och dissektion (TAAD) är en lokaliserad dilatation eller delaminering av aortaväggen som är förknippad med hög sjuklighet och dödlighet1. Mänskliga aorta glattmuskelceller (HASMC) spelar en viktig roll i patogenesen av TAAD. HASMC är inte terminalt differentierade celler, och HASMC behåller hög plasticitet, vilket gör att de kan byta fenotyper som svar på olika stimuli2. HASMC utsätts huvudsakligen för rytmisk dragspänning in vivo, och detta är en av de viktigaste faktorerna som reglerar glattmuskelmorfologiska förändringar, differentiering och fysiologiska funktioner 3,4. Därför kan rollen av cyklisk stam i studien av HASMC inte ignoreras. Konventionella 2D-cellkulturer kan emellertid inte replikera den biomekaniska stimuleringen av cyklisk stam som upplevs av HASMC in vivo. Dessutom är konstruktionen av en TAAD-modell för djur inte lämplig för vissa typer av TAAD, såsom bicuspid aortaklaffen (BAV) -relaterad TAAD. Dessutom kan artklyftan mellan kliniska studier på människa och djurförsök inte ignoreras. Det hindrar läkemedelsöversättning i klinisk praxis. Således finns det ett brådskande behov av mer komplexa och fysiologiska system för att simulera den biomekaniska miljön in vivo i forskningen om aortasjukdomar.
Djurförsök som används inom biomedicinsk forskning och läkemedelsutveckling är kostsamma, tidskrävande och etiskt tveksamma. Dessutom misslyckas resultaten från djurstudier ofta med att förutsäga de resultat som erhållits i kliniska prövningar på människa 5,6. Bristen på humana prekliniska modeller och hög felfrekvens i kliniska prövningar har resulterat i få effektiva läkemedel för kliniken, vilket har ökat sjukvårdskostnaderna7. Därför är det angeläget att hitta andra experimentella modeller som komplement till djurmodeller. Mikrofabrikation och mikrofluidiktekniker har utvecklats mycket under de senaste åren och ger nya tekniker för att etablera organoider-på-ett-chip-modeller som avhjälper nackdelarna med traditionella 2D-cellodlingstekniker och etablerar en mer realistisk, billig och effektiv in vitro-modell för fysiologiska studier och läkemedelsutveckling. Med hjälp av mikrofluidiska anordningar etableras organ-på-chips för att odla levande celler i mikrometerstora kamrar med olika stimuli för att replikera nyckelfunktionerna hos en vävnad eller ett organ. Systemet består av enstaka eller flera mikrofluidiska mikrokanaler, där antingen en typ av cell odlas i en perfuserad kammare som replikerar funktioner av en vävnadstyp eller olika celltyper odlade på porösa membran för att återskapa gränssnitt mellan olika vävnader. Mikrofluidikbaserade organoider i kombination med patient-härledda celler har den unika fördelen att överbrygga den stora artskillnaden mellan mus- och mänskliga sjukdomsmodeller och övervinna nackdelarna med traditionell 2D-cellodling för sjukdomsmekanismforskning och läkemedelsupptäckt. Med den snabba utvecklingen av mikrofluidik under de senaste åren har forskare insett användbarheten av in vitro-organ-on-a-chip (OOC) -modeller som replikerar komplexa in vivo biologiska parametrar8. Dessa mikrofluidiska organoider simulerar in vitro biomekaniska miljöer, såsom cyklisk stam, skjuvspänning och vätsketryck, vilket ger en tredimensionell (3D) cellodlingsmiljö. Hittills har flera OOC-modeller etablerats för att simulera biomekaniska stimuli i organ som lungan9, njure 10, lever 11, tarm12 och hjärta 13, men dessa har inte tillämpats i stor utsträckning för studier av mänsklig aortasjukdom.
I denna studie presenterar vi en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip (HASMC-OOC) modell som kan styra de biomimetiska mekaniska krafter och rytmer som tillämpas på TAAD patient-härledda primära HASMCs. Chipet består av treskiktade tjocka plattor av polydimetylsiloxan (PDMS) etsade med kanaler och två kommersialiserade mycket flexibla PDMS-membran. HASMC odlas på PDMS-membranen. Kanalen i mitten av chipet är fylld med ett odlingsmedium för cellodling. Chipets övre och nedre kanaler är anslutna till ett vakuumtryckförsörjningssystem som kan styra rytmen och frekvensen för mekanisk dragspänning hos PDMS-membranen. Rytmisk belastning som upplevs av HASMC kan simuleras i HASMC-OOC, vilket replikerar den biomekaniska mikromiljön hos vävnad eller organ som inte är funktionellt uppnåeliga med konventionella 2D-odlingssystem. Med fördelen av högupplöst, realtidsavbildning och biomekanisk mikromiljö kan de biokemiska, genetiska och metaboliska aktiviteterna hos levande celler studeras för vävnadsutveckling, organfysiologi, sjukdomsetiologi, molekylära mekanismer och biomarköridentifiering, hjärt-kärlsjukdom och aortasjukdom. I kombination med vävnadsspecifika och patientceller kan detta system användas för läkemedelsscreening, personlig medicin och toxicitetstestning. Denna HASMC-OOC-modell ger en ny in vitro-plattform för att studera patogenesen av aortasjukdomen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td>Used for cell immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0408</td>
			<td>Antibodies used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST025-20g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium AM/PI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>Ab46794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flexible 
			PDMS membrane</td>
			<td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td>
			<td>KYQ-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoses</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>96410</td>
			<td>1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human aortic smooth 
			muscle cell line CRL1999</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Lot Number:70019189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Imagej.net/fiji/downloads</td>
			<td>Free Download: https://fiji.sc</td>
			<td>Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Ensures that the temperature, 
			humidity, and light exposure is 
			exactly the same throughout 
			experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer</td>
			<td>Runze Fluid</td>
			<td>RH-M016</td>
			<td>Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse collagen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma&#160;</td>
			<td>Changzhou Hongming Instrument</td>
			<td>HM-Plasma5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>30-0138A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0221A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458-100ml</td>
			<td>Antibiodics used to prevent bacterial 
			contamination of cells during culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>F01A-STP-B046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC controller</td>
			<td>Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory</td>
			<td>BR010-11T8X2M</td>
			<td>The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMCM</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>Cat 1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>VQZ300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST795</td>
			<td>To penetrate cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum filter</td>
			<td>SMC (China)</td>
			<td>ZFC5-6</td>
			<td>Official website address: https://www.smc.com.cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>Kamoer</td>
			<td>KVP15-KL-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum regulator</td>
			<td>AirTAC</td>
			<td>GVR-200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Name</td>
			<td>Forward (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td>Reverse (5&#8217; to 3&#8217;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM22</td>
			<td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td>
			<td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNN1</td>
			<td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td>
			<td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a human aorta smooth muscle cell organ-on-a-chip model for recapitulating biomechanical strain in the aortic wall

Konventionella tvådimensionella cellodlingstekniker och djurmodeller har använts i studien av human thoraxaortaaneurysm och dissektion (TAAD). Men mänsklig TAAD kan ibland inte karakteriseras av djurmodeller. Det finns ett uppenbart artgap mellan kliniska studier på människa och djurförsök som kan hindra upptäckten av terapeutiska läkemedel. Däremot kan den konventionella cellodlingsmodellen inte simulera in vivo biomekaniska stimuli. För detta ändamål har mikrofabrikation och mikrofluidiktekniker utvecklats kraftigt under de senaste åren och gett nya tekniker för att etablera organoider-på-ett-chip-modeller som replikerar den biomekaniska mikromiljön. I denna studie utvecklades en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip (HASMC-OOC) modell för att simulera de patofysiologiska parametrarna för aortabiomekanik, inklusive amplituden och frekvensen av cyklisk belastning som upplevs av humana aorta glattmuskelceller (HASMCs) som spelar en viktig roll i TAAD. I denna modell blev morfologin hos HASMC långsträckt i form, justerad vinkelrätt mot töjningsriktningen och presenterade en mer kontraktil fenotyp under töjningsförhållanden än under statiska konventionella förhållanden. Detta överensstämde med cellorienteringen och fenotypen i infödda mänskliga aortaväggar. Dessutom, med hjälp av bicuspid aortaklaffrelaterad TAAD (BAV-TAAD) och tricuspid aortaklaffrelaterad TAAD (TAV-TAAD) patient-härledd primär HASMCs, etablerade vi BAV-TAAD och TAV-TAAD sjukdomsmodeller, som replikerar HASMC-egenskaper i TAAD. HASMC-OOC-modellen tillhandahåller en ny in vitro-plattform som kompletterar djurmodeller för att ytterligare utforska patogenesen av TAAD och upptäcka terapeutiska mål.

HASMC-OOC-modellen består av ett vakuumstyrsystem, ett cirkulationssystem och PDMS-chips och den schematiska utformningen av HASMC-OOC-modellen (figur 1). Vakuumstyrsystemet består av en vakuumpump, magnetventiler och en PLC-styrenhet. För att fungera som cirkulationssystem användes en peristaltisk pump för att uppdatera cellodlingsmediet och tillsätta läkemedel. PDMS-chipet bestod av två vakuumkammare och en mellankammare fylld med SMCM för celltillväxt. Enligt utformningen av chi...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall at JoVE.com

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Här utvecklade vi en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip-modell för att replikera den in vivo biomekaniska stammen av glattmuskelceller i den mänskliga aortaväggen.

Konstruktion av en human aorta glatt muskelcell organ-on-a-chip modell för rekapitulering av biomekanisk belastning i aortaväggen

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Denna modell stimulerar biomekaniska stimuli som upplevs av glattmuskelceller i human aorta. I kombination med patienter härledda celler kan detta system användas för läkemedelsscreening och personlig medicin av aortasjukdomar. Denna modell kan efterlikna och exakt kontrollera de nakna mekaniska parametrarna för glattmuskelcellerna i human aorta, vilket ger en ny in vitro-plattform för att studera och patogenes av aortasjukdomar.Demonstrerar proceduren kommer att vara Mieradilijiang Abudubat, en affischläkare från vårt laboratorium. Börja med att tvätta den högra sidoregionen av den stigande aortan med sterila pbs, en eller två gånger. Ta bort intima och ett adventitia-lager av vävnaden med två oftalmiska pincett och behåll medieskiktet för att skörda cellerna.Lägg medieskiktet på en 10 centimeter skål och skär det i två till tre millimeter bitar. Tillsätt sedan fem milliliter SMCM som innehåller 10% fbs och 1% penicillinstreptomycin till vävnadsproverna. Flytta den lilla vävnaden i odlingsflaskan med en steril droppare och sprid vävnaden jämnt.Kassera odlingsmediet så mycket som möjligt. Vänd sedan flaskan upp och ner. Tillsätt två milliliter SMCM i den inverterade odlingsflaskan och placera den i inkubatorn med 5% koldioxid vid 37 grader Celsius i en till två timmar.Vrid sedan långsamt höger sida uppåt och tillsätt ytterligare två milliliter SMCM. Efter fem till sju dagars inkubation, byt ut SMCM med fyra milliliter färsk SMCM. Kasta långsamt och lägg till SMCM när du byter medium.I allmänhet klättrar sporadiska glattmuskelceller ut på cirka två veckor. Transportera odlingsflaskan försiktigt när du flyttar till en mikroskopstation. Annars kommer vävnaderna att flyta och cellerna växer långsamt.När cellerna har vuxit, dela dem i två nya odlingsflaskor med fyra milliliter färsk SMCM. Identifiera cellerna genom en immunofluorescensanalys av fyra specifika markörer för glattmuskelceller. För att polymerisera PDMS, tillsätt härdningsmedlet eller B-komponenten till basen eller A-komponenten och blanda komplexet i fem minuter.Volymen beror på studiens behov. Placera den beredda PDMS-gelén i en vakuumutsugningstank i 30 till 60 minuter och håll trycket under negativa 0,8 milli pascal. Med hjälp av datorstödd designprogramvara designar du formen.Skräddarsy formarna i de tre lagren med hjälp av en dator med hög precision numerisk kontrollgravyrmaskin. Efter att ha huggit ut ramen på formarna och mikrokanalerna med PMMA-plattor, limma dem på en annan platta. Häll den beredda PDMS-gelén på en designad form.Tvärlänka sedan vid 70 grader Celsius i en till två timmar. Skala av de tvärbundna PDMS-plattorna från formen och skär de kommersialiserade PDMS-membranen i 100 millimeter med 40 millimeter sektioner. Stansa hål på de tre PDM-plattorna med en millimeter hålslagare för att göra inlopp och utlopp av luft och medelstora mikrokanaler på PDMS-chipet.Behandla de tre beredda PDMS-plattorna och två PDMS-membran med syreplasma i fem minuter för PDM-ytaktivering. Ställ in rumsluften för att bearbeta gas, tryck till negativa 100 kilopascal, ström till 180 till 200 milliampere bryggor, spänning till 200 volt och bearbetningstiden till fem minuter. Bind samman tre PDMS-plattor och två PDMS-membran under ett stereoskopiskt mikroskop, så att det översta lagret består av luftkanalens PDMS-platta, sedan PDMS-membranet.Mediumkanalen består av PDMS-plattan, sedan PDM-membranet, och bottenskiktet är luftkanalens PDMS-platta. Placera det monterade PDMS-chipet i en 70 grader Celsius inkubator i en timme. Förbered flera en millimeter innerdiameter och tre centimeter långa latexslangar.Sätt in en millimeter ytterdiameter och en centimeter lång nål i rostfritt stål i ena änden av den förberedda slangen. Sätt sedan in ett lock i den andra änden av slangen för att skapa röret anslutet till luften och medelstora mikrokanaler på PDMS-chipet. Sätt in de förberedda rören i utloppen och inloppen i luften och medelstora mikrokanaler på PDMS-chipet.Infusera två milliliter 80 milligram per milliliter muskollagen i PDM-chipets mediummikrokanal med en två milliliter spruta och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Efter inkubation, ta bort kollagenet från kanalen med en två milliliter spruta. Placera de kollagenkodade PDMS-chipsen i en 60 graders Celsius-inkubator över natten.Placera PDMS-chipsen i en UV-sterilisator i mer än en timme. Placera de steriliserade PDMS-chipsen på en ultraren bänk som förberedelse för cellexperimentet. Odling fyra gånger 10 till de fem primära humana aorta glattmuskelcellerna från patienter som använder SMCM innehållande 2% FBS och 1% penicillin streptomycin i en 5% koldioxidinkubator, inställd på 37 grader celsius.När glattmuskelcelldensiteten når 80% kassera SMCM och tvätta cellerna med två milliliter PPS. Smält cellerna med en milliliter 0,25% tripsin i två minuter och centrifugera vid 100 RCF i fem minuter. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i en milliliter färsk SMCM.Använd åtta milliliter SMCM för att odla cellerna på en 10 centimeter odlingsskål. Använd en cytometer, beräkna cellnumret och fortsätt med den slutliga koncentrationen av två gånger 10 till de fem cellerna per milliliter. Häll långsamt två milliliter PBS i den kollagenkodade och steriliserade PDMS-chipmediemikrokanalen och kassera senare med en två milliliter spruta.Häll långsamt två milliliter av två gånger 10 till de fem cellerna per milliliter glattmuskelcellssuspension i PDMS-chipets mediemikrokanal. Stäng sedan locket vid ingången och utgången av PDMS-chipet. Placera PDMS-chipet i en inkubator, inställd på 37 grader celsius med 5% koldioxid under en dag.Efter inkubation, när cellerna är fästa vid PDMS-membranet i PDMS-chipet, anslut luftmikrokanalens utlopp på PDMS-chipet till vakuumstyrsystemet. En långsträckt normal cellulär form kommer att ses under mikroskopet när cellen är fäst. Kontrasterar med de upphängda runda cellerna.Slå på magnetventilen och vakuumpumpen. Öppna vakuumregulatorn och justera trycknivån beroende på stammarna. Placera sedan PDMS-chipsen och en inkubator inställd på 37 grader celsius med 5% koldioxid i 24 timmar.Förbered flera magnetventiler, vakuumfilter, vakuumregulatorer, en vakuumpump, en peristaltisk pump och en PLC som styr magnetventilen. Programmera PLC-styrenheten och ställ in på off-tidsintervallet till en hertz. Anslut magnetventilerna till den programmerade styrenheten.Anslut vakuumpumpens inlopp till vakuumfiltren och anslut sedan vakuumfiltrens utlopp till vakuumregulatorerna. Anslut vakuumregulatorernas utlopp till magnetventiler. Och slutligen, anslut magnetventilernas utlopp till utloppen på luftmikrokanalerna på PDMS-chipsen.Anslut utloppet från den peristaltiska pumpen till inloppet till PDMS-chipets mediummikrokanal och inloppet till den peristaltiska pumpens utlopp till utloppet från det medelstora mikrokanals PDMS-chipet för byte av odlingsmedium och läkemedelshantering. Justera amplituden för stammen av regulatorn och töjningsfrekvensen av mikroregulatorn. Livskraften hos den mänskliga aorta glattmuskelcellinjen, CRL 1990, i PDMS-chipet, uppskattades med hjälp av en levande och död analys på den tredje och femte dagen av cellodlingen.Cellviabiliteten befanns högre än 90% på dag tre och dag fem. Cytoskelett F-aktinfärgning av CRL 1990, i PDMS-chipet, visade normal cellmorfologi och celler riktade vinkelrätt mot stammen efter att ha sträckt sig i 24 timmar. Immunofluorescensen av kontraktilmarkörerna SM22 och CNN1 var högre under töjningsförhållanden jämfört med de statiska förhållandena.Även SM22- och CNN1-generna var uppreglerade under stamförhållanden av glattmuskelceller. F-aktinfärgningen av BAV och TAV, bröstaortaaneurysm och dissektion av patient-härledda primära humana aorta glattmuskelceller, visade normal cellmorfologi och celler i linje vinkelrätt mot töjningsriktningen efter sträckning i 24 timmar. SM22- och CNN1-fluorescensen i BAVTAAD och TAV thoraxaortaaneurysm och dissektion var högre under töjningsförhållanden än under statiska förhållanden.Liknar genuttrycksnivåerna för SM22 och CNN1, som också var uppreglerade under stamförhållanden jämfört med statiska förhållanden. Uppmärksamhet bör ägnas åt principen om sterilitet vid isolering av primär HASMC. Efter att PDMS-laboratorierna och membranen har behandlats med plasma bör ytorna inte smutsas.Baserat på detta protokoll kan endotelceller odlas tillsammans med glattmuskelceller och den stora stressen kan ges till cellerna med cyklisk belastning för att ytterligare simulera mer mekaniska krafter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Riktad Cellular Self-Assembly att tillverka-cellerna Tissue Ringar för Biomekaniska analys och Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterande Cell Culture System för mänskliga Cell Culture: Mänskliga trofoblasten Celler som modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Övervakning av Wall Mechanics Under stentutveckling i ett kärl

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Förbättrad metod för framställning av en human cellbaserad, Kontakta modell av blod-hjärnbarriären

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Konstruktion av en flercellig 3D Scaffold för Leverans av Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Anpassning av Electro processen med att ge tre unika miljöer för en Tri-lager<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust Paracellulär permeabilitet markör i en cell modell av den mänskliga blod-hjärnbarriären

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...