Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

نود أن نشكر شبكة البحوث الطبية الحيوية في السرطان (CIBERONC) على دعمها ومنحة المشروع التالية: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC PLATFORM لتوحيد وتعزيز الخزعة السائلة. PI رودريغو توليدو ، (CIBERONC) ، 2019-2021.

تم الحصول على موافقة أخلاقية مسبقة من المراكز المشاركة قبل استخراج عينات الدم. تم تنفيذ البروتوكولات التالية لعزل المصل والبلازما وفقا للمبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية الحيوية.
ملاحظة: يتم توفير الاعتبارات السابقة قبل بدء البروتوكول هنا. مطلوب موافقة أخلاقية مسبقة لاستخد?...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في أوقات مختلفة أثناء إدارة السرطان. أولا ، عند التشخيص لتحديد العلامات الجزيئية للورم التي من شأنها أن تشير إلى وجود آفة ورم محتملة يمكن التحقيق فيها سريريا. ثانيا ، أثناء العلاج للمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، وتقييم الاستجابة الجزيئية ل...

تم تعريف مصطلح "الخزعة السائلة" في عام 20101 على أنه وجود جزيئات (مثل البروتين أو الحمض النووي الريبي النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA)) أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية (على سبيل المثال ، الإكسوسومات) في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي. أحدث استخدام عينات الخزعة السائلة ثورة في أبحاث الأورام الانتقالية حيث أن خزعات الأنسجة ، التي تقتصر على منطقة معينة في لحظة معينة ، قد تفوت النسخ المستنسخة ذات الصلة بسبب عدم تجانس الورم. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الخزعة السائلة دورا ذا صلة في أنواع الأورام حيث تكون الأنسجة الأولية نادرة أو لا يمكن الوصول إليها ، لأنها قد تتجنب الخزعة الغازية ، مما يقلل من التكاليف والمخاطر على المرضى. علاوة على ذلك ، تتطور الخصائص الجزيئية للورم باستمرار ويرجع ذلك أساسا إلى ضغط العلاج ، ويمكن لعينات الخزعة السائلة التقاط الديناميكيات النسيلية للورم حيث يمكن أخذها طوليا ، في أوقات سريرية وعلاجية مختلفة من المرض مثل خط الأساس ، على العلاج ، أفضل استجابة ، وعند تطور المرض أو حتى قبل ذلك. مفهوم "الخزعة السائلة في الوقت الحقيقي" يعني أنه يمكن مراقبة التغيرات الديناميكية في الورم في الوقت الفعلي ، مما يسمح بالطب الدقيق في هذا المرض. الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في العيادة ، بما في ذلك الفحص والكشف المبكر عن السرطان ، والمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، والكشف عن الحد الأدنى من الأمراض المتبقية ، ودراسة آليات مقاومة العلاج ، والتقسيم الطبقي للمرضى على المستوى العلاجي1. يعد الكشف المبكر عن تكرار المرض وتطوره حاجة سريرية غير ملباة في العديد من أنواع الأورام وهو عامل رئيسي في زيادة بقاء مرضى السرطان على قيد الحياة ونوعية حياتهم. قد تفتقر طرق التصوير الروتينية وعلامات الورم القابلة للذوبان إلى الحساسية و / أو الخصوصية المطلوبة لهذه المهمة. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى علامات تنبؤية جديدة في العيادة ، مثل تلك القائمة على تعميم الأحماض النووية الحرة.
تشمل أنواع العينات المستخدمة في دراسات الخزعة السائلة على سبيل المثال لا الحصر عينات الدم والبول واللعاب والبراز. يمكن أن تكون العينات الأخرى الخاصة بالورم عبارة عن شفطات الخلايا والسائل الدماغي الشوكي والسائل الجنبي والكيس وسائل الاستسقاء والبلغم وعصير البنكرياس2. قد تحتوي السوائل السابقة على أنواع مختلفة من المواد المشتقة من السرطان ، أو الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) ، أو شظايا مثل الإكسوسومات والحمض النووي للورم المتداول الخالي من الخلايا (ctDNA). قد يتم تغليف الأحماض النووية في حويصلات خارج الخلية (EVs) أو إطلاقها في سوائل الجسم بسبب موت الخلايا وتلفها. يتم إطلاق الحمض النووي الحر المنتشر (cfDNA) بشكل رئيسي في مجرى الدم من الخلايا الماصة أو الميتة وهو موجود في جميع الأفراد ، مما يدل على زيادة المستويات في الأمراض الالتهابية أو الأورام3. Exosomes هي حويصلات صغيرة خارج الخلية (~ 30-150 نانومتر) تفرزها الخلايا التي تحتوي على الأحماض النووية والبروتينات والدهون. تشكل هذه الحويصلات جزءا من شبكة الاتصالات بين الخلايا وتوجد عادة في العديد من أنواع سوائل الجسم2. الأحماض النووية المغلقة داخل المركبات الكهربائية محمية من البيئة القاسية داخل سوائل الجسم، وبالتالي توفير طريقة أكثر قوة لدراسة هذه الجزيئات في إعداد الخزعة السائلة.
وعموما، فإن مستويات الأحماض النووية المتداولة في عينات الخزعة السائلة منخفضة جدا، وبالتالي هناك حاجة إلى طرق حساسة للكشف، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي أو تسلسل الجيل التالي (NGS). تعد الإدارة قبل التحليلية للعينة أمرا بالغ الأهمية لمنع تحلل خلايا الدم وإطلاق الحمض النووي السليم ، مما يتسبب في تلوث cfDNA بالحمض النووي الجينومي. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر عند استخراج العينات لتجنب وجود مثبطات لطرق التحليل القائمة على الإنزيم.
نقدم هنا طريقة موحدة لجمع وتخزين عينات البلازما والمصل ، وهي خطوة أولى حاسمة للتطبيقات النهائية القائمة على الخزعة السائلة ، بما في ذلك تحليلات الحمض النووي المتداولة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

يشير مصطلح الخزعة السائلة (LB) إلى جزيئات مثل البروتينات أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي و / أو النقيلي. برز LB كدعامة أساسية في البحوث الانتقالية وبدأ يصبح جزءا من ممارسة الأورام السريرية ، مما يوفر بديلا طفيف التوغل للخزعة الصلبة. يسمح LB بمراقبة الورم في الوقت الفعلي عن طريق استخراج عينة طفيفة التوغل ، مثل الدم. وتشمل التطبيقات الكشف المبكر عن السرطان، ومتابعة المرضى للكشف عن تطور المرض، وتقييم الحد الأدنى من الأمراض المتبقية، والتحديد المحتمل للتطور الجزيئي وآلية المقاومة. من أجل تحقيق تحليل موثوق به لهذه العينات التي يمكن الإبلاغ عنها في العيادة ، يجب النظر بعناية في إجراءات ما قبل التحليل واتباعها بدقة. يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة تحدد فائدتها في التطبيقات النهائية. هنا ، نقدم بروتوكولات موحدة من وحدة عمل الخزعة السائلة الخاصة بنا لجمع ومعالجة وتخزين عينات البلازما والمصل لتحليل الخزعة السائلة في المصب بناء على الحمض النووي الخالي من التداول. تتطلب البروتوكولات المعروضة هنا معدات قياسية ومرنة بما يكفي لتطبيقها في معظم المختبرات التي تركز على الإجراءات البيولوجية.

بعد الطرد المركزي لأنابيب الدم بدون مضادات التخثر ، تظهر المرحلة العليا باللون الأصفر الباهت وتتوافق مع جزء المصل (الشكل 2). تتم إزالة هذا الكسر بعناية واقتباسه للتحليل اللاحق.
قد يكون انحلال الدم موجودا إما في جزء البلازما أو المصل ، وسيكون للمرحلة العليا م?...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

لقد أحدثت الخزعة السائلة ثورة في نهجنا في الدراسات الانتقالية لعلم الأورام ، حيث يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة لتطبيقها السريري الناجح. هنا نصف بروتوكولا موحدا ومعتمدا لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية والتي يمكن تطبيقها في معظم مختبرات الأبحاث الانتقالية.

بروتوكول ما قبل التحليل المسبق للخزعة السائلة الموحدة لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

هذا بروتوكول قياسي لمعالجة وتخزين عينات الدم لتطبيقات الخزعة السائلة في المصب على أساس تعميم الحمض النووي الحر. هذا هو أول بروتوكول قياسي يتم نشره ، على الرغم من أن هذه التقنية كانت قيد الاستخدام لعدة سنوات. من السهل اتباعها مع المعدات القياسية المتوفرة في معظم المختبرات الانتقالية أو العلمية.ويمكن لجميع موظفي المختبر تنفيذ البروتوكول. يساعد البروتوكول على توحيد كيفية جمع العينات وتخزينها ، مما سيؤثر في النهاية في العيادة ويقلل من التباين بين المراكز المختلفة التي تجري نفس التحليل النهائي أو ما شابهه حيث تكون الدقة ذات أهمية قصوى. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في أبحاث الأورام وأيضا في التطبيقات السريرية.ومع ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا في أمراض أخرى غير سرطانية حيث يتم استخدام الخزعة السائلة أيضا. بعد أن يتم طرد عينة الدم مركزيا ، قد يكون من الصعب معرفة كمية البلازما أو المصل المطلوب إزالتها ، ولكن اتباع هذه الإرشادات المحددة سيساعد في ذلك. من السهل جدا اتباع بقية البروتوكول مع خبرة محدودة في المختبر.سيوضح الإجراء خورخي ، وهو فني من مختبرنا. للبدء ، قم بالطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على دم طازج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 1600 مرة غرام ، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر. قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي.ستظهر المرحلة العليا من supernatant المصل واضحة ومصفرة. تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم وسجل وجود انحلال الدم عند الاقتضاء. في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية ، انقل المصل إلى أنابيب التجميع كأليكوتات سعة 250 ميكرولتر.يجب تسمية الأليكوتات بشكل صحيح. قم بتجميد المصل على الفور في وضع مستقيم في صندوق التخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وسجل وقت تخزين العينة. تحقق من معالجة العينات خلال الإطار الزمني المطلوب البالغ أربع ساعات.قم بطرد مركزي لأنبوب EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 1600 مرة جم ، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر. بعد الطرد المركزي ، سيظهر السوبرنات البلازما واضحا ومصفرا. تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم ونقل البلازما إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر دون إزعاج الطبقة الخلوية باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها.اترك كمية صغيرة متبقية من البلازما فوق طبقة الخلية عند حوالي خمسة ملليمترات. إذا لوحظ انحلال الدم ، فتجاهل العينة لمزيد من التحليل. جهاز طرد مركزي للبلازما وأنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر لإزالة أي خلايا دم سليمة متبقية تم نقلها من خطوة الطرد المركزي الأولى.قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي ، وليس بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب ، وانقل واحدا إلى أربعة ملليلترات من البلازما إلى واحد إلى أربعة ملليلتر من البولي بروبيلين المبرد أو Eppendorfs باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها. يجب ترك الحجم المتبقي من البلازما في أسفل الأنبوب لتجنب تلويث البلازما بخلايا الدم. قم بتجميد البلازما على الفور في وضع مستقيم في صندوق التخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وسجل وقت تخزين العينة.تحقق من أن العينات قد تم تصنيفها بشكل صحيح وتمت معالجتها خلال الإطار الزمني المطلوب لمدة أربع ساعات. جمع الطبقة الخلوية باستخدام P1000 وطرف مصفى ونقلها إلى أنبوب 2 ملليلتر. تجمد على الفور وتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.يظهر هنا مثال على استخراج cfDNA عالي الجودة الذي يمكن استخدامه في التطبيقات النهائية ، في حين تمثل هذه الصورة الرسومية مثالا على عينة غير مناسبة ذات مستوى عال من التلوث الجينومي. يجب أن يكون جزء البلازما أو المصل أصفر اللون. قد يختلف هذا اعتمادا على العينة الفردية.يجب التخلص من العينات المصابة بانحلال الدم. احرص على عدم إزالة أي حبيبات خلية عند إزالة جزء البلازما. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول في تطبيقات أخرى قائمة على الأحماض النووية والبروتينات ، مثل الكشف عن الحمض النووي الريبي غير المشفر أو البروتينات في عينات المصل والبلازما باستخدام تقنيات الكشف المناعي.هذه تقنية قياسية للغاية تستخدم في العديد من المختبرات. يساعد هذا البروتوكول الباحثين على توحيد كيفية إجراء تحليلنا لأن هذا جانب حاسم وضروري للتطبيقات السريرية المستقبلية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

ميكرورنا استناداً إلى خزعة سائلة: تجربة ميرنا البلازما التوقيع المصنف (MSC) "فحص سرطان الرئة"

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

وركز التقييم لجدوى والسلامة، ودقة عالية الكثافة الموضعية جهاز الموجات فوق الصوتية لعلاج الانبثاث الكبد

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

التصوير التحيئي الطولي لسلوك خلايا أورام الدماغ استجابة لخزعة جراحية غازية

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

التحليل الجزئي للخلايا السرطانية المتداولة للتحليل الجزيئي المصب والتقييم المحتمل المنتشر

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

بروتوكول التشريح الآلي لإثراء الورم في الأنسجة منخفضة محتوى الورم

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...