Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

Vi vil gerne takke Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) for deres støtte og følgende projektbevilling: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC platform til standardisering og fremme af flydende biopsi. Pi Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Forudgående etisk godkendelse blev opnået fra deltagende centre inden ekstraktion af blodprøver. Følgende protokoller for serum- og plasmaisolering blev udført i overensstemmelse med de etiske principper for biomedicinsk forskning.
BEMÆRK: Forudgående overvejelser, inden protokollen påbegyndes, findes her. Der kræves forudgående etisk godkendelse af anvendelsen af humanprøver i biomedicinsk forskning med det tilsvarende informerede samtykke. Et klasse II biosikkerhedsskab er påkræ...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

Den flydende biopsi har mange potentielle anvendelser på forskellige tidspunkter under behandling af kræft. For det første ved diagnosen for at identificere tumormolekylære markører, der tyder på tilstedeværelsen af en potentiel tumorlæsion, der kan undersøges yderligere klinisk. For det andet under behandling til realtidsovervågning af sygdommen, vurdering af behandlingsmolekylær respons, klonal udvikling og tidlig påvisning af sygdomstilbagefald eller behandlingsresistens. Endelig efter den kirurgiske behan...

Udtrykket "flydende biopsi" blev defineret i 20101 som tilstedeværelsen af molekyler (fx protein, deoxyribonukleinsyre (DNA), ribonukleinsyre (RNA)), celler eller ekstracellulære vesikler (fx exosomer) i blod og andre kropsvæsker, der stammer fra den primære tumor. Anvendelsen af flydende biopsiprøver har revolutioneret translationel onkologisk forskning, da vævsbiopsier, der er begrænset til en bestemt region på et bestemt tidspunkt, kan gå glip af relevante kloner på grund af tumor heterogenitet. Derudover spiller flydende biopsi en relevant rolle i tumortyper, hvor primært væv er knappe eller ikke tilgængelige, da det kan undgå en invasiv biopsi, hvilket reducerer omkostninger og risiko for patienter. Desuden udvikler tumormolekylære egenskaber sig konstant hovedsageligt på grund af terapitrykket, og flydende biopsiprøver kan fange tumorklonaldynamikken, da de kan tages i længderetningen i forskellige kliniske og terapeutiske tider af sygdommen, såsom baseline, ved behandling, bedste respons og ved sygdomsprogression eller endda før. Begrebet "real-time flydende biopsi" betyder, at dynamiske ændringer i tumoren kan overvåges i realtid, hvilket muliggør præcisionsmedicin i denne sygdom. Den flydende biopsi har adskillige potentielle anvendelser i klinikken, herunder screening og tidlig påvisning af kræft, realtidsovervågning af sygdom, påvisning af minimal restsygdom, undersøgelse af mekanismer til behandlingsresistens og stratificering af patienter på terapeutisk niveau1. Tidlig påvisning af sygdomsgenfald og progression er et uopfyldt klinisk behov i mange tumortyper og er en nøglefaktor for at øge kræftpatienters overlevelse og livskvalitet. Rutinemæssige billeddannelsesmetoder og opløselige tumormarkører kan mangle den følsomhed og / eller specificitet, der kræves til denne opgave. Således er der et presserende behov for nye forudsigelige markører i klinikken, såsom dem, der er baseret på cirkulerende frie nukleinsyrer.
De typer prøver, der anvendes til flydende biopsiundersøgelser, omfatter, men er ikke begrænset til, blod-, urin-, spyt- og afføringsprøver. Andre tumorspecifikke prøver kan være celleaspirater, cerebrospinalvæske, pleurvæske, cyste og ascitesvæske, sputum og bugspytkirtelsaft2. De tidligere væsker kan indeholde forskellige typer kræftafledte materialer, cirkulerende tumorceller (CTC) eller fragmenter såsom exosomer og cellefrit cirkulerende tumor-DNA (ctDNA). Nukleinsyrer kan indkapsles i ekstracellulære vesikler (EV'er) eller frigives i kropsvæsker på grund af celledød og skade. Cirkulerende frit DNA (cfDNA) frigives hovedsageligt i blodbanen fra apoptotiske eller nekrotiske celler og er til stede hos alle individer, hvilket viser øgede niveauer i inflammatoriske eller onkologiske sygdomme3. Exosomer er små ekstracellulære vesikler (~ 30-150 nm) udskilt af celler indeholdende nukleinsyrer, proteiner og lipider. Disse vesikler udgør en del af det intercellulære kommunikationsnetværk og findes almindeligvis i mange typer kropsvæsker2. Nukleinsyrerne indesluttet i elbiler er beskyttet mod det barske miljø i kropsvæsker, hvilket giver en mere robust måde at studere disse molekyler i den flydende biopsiindstilling.
Samlet set er niveauerne af cirkulerende nukleinsyrer i flydende biopsiprøver meget lave, og derfor er følsomme metoder nødvendige til påvisning, såsom digital PCR eller næste generations sekventering (NGS). Præanalytisk styring af prøven er afgørende for at forhindre blodcellelyse og frigivelse af intakt DNA, hvilket forårsager forurening af cfDNA med det genomiske DNA. Desuden skal der udvises forsigtighed ved ekstraktion af prøver for at undgå tilstedeværelse af inhibitorer af enzymbaserede analysemetoder.
Her præsenterer vi en standardiseret metode til indsamling og opbevaring af plasma- og serumprøver, hvilket er et afgørende første skridt for flydende biopsibaserede downstream-applikationer, herunder cirkulerende nukleinsyreanalyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

Udtrykket flydende biopsi (LB) refererer til molekyler såsom proteiner, DNA, RNA, celler eller ekstracellulære vesikler i blod og andre kropsvæsker, der stammer fra den primære og / eller metastatiske tumor. LB er opstået som en grundpille i translationel forskning og er begyndt at blive en del af klinisk onkologisk praksis, hvilket giver et minimalt invasivt alternativ til fast biopsi. LB tillader realtidsovervågning af en tumor via en minimalt invasiv prøveekstraktion, såsom blod. Ansøgningerne omfatter tidlig påvisning af kræft, patientopfølgning til påvisning af sygdomsprogression, vurdering af minimal restsygdom og potentiel identifikation af molekylær progression og resistensmekanisme. For at opnå en pålidelig analyse af disse prøver, der kan rapporteres i klinikken, bør de præanalytiske procedurer overvejes nøje og følges nøje. Prøveindsamling, kvalitet og opbevaring er afgørende trin, der bestemmer deres anvendelighed i downstream-applikationer. Her præsenterer vi standardiserede protokoller fra vores arbejdsmodul til flydende biopsi til indsamling, behandling og opbevaring af plasma- og serumprøver til downstream flydende biopsianalyse baseret på cirkulerende frit DNA. De protokoller, der præsenteres her, kræver standardudstyr og er tilstrækkeligt fleksible til at blive anvendt i de fleste laboratorier med fokus på biologiske procedurer.

Efter centrifugering af blodrørene uden antikoagulant vises den øvre fase en lysegul og svarer til serumfraktionen (figur 2). Denne fraktion fjernes omhyggeligt og aliquoteres til efterfølgende analyse.
Hæmolyse kan være til stede i enten plasma- eller serumfraktionen, og den øvre fase vil have et rødligt udseende, hvilket indikerer tilstedeværelsen og graden af hæmolyse (figur 3).
Efter centrifuge...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

Den flydende biopsi har revolutioneret vores tilgang til onkologiske translationelle undersøgelser, hvor prøveindsamling, kvalitet og opbevaring er afgørende skridt for dens vellykkede kliniske anvendelse. Her beskriver vi en standardiseret og valideret protokol til downstream cirkulerende-frie DNA-applikationer, der kan anvendes i de fleste translationelle forskningslaboratorier.

En standardiseret præanalytisk protokol for flydende biopsi til downstream-cirkulerende DNA-applikationer

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Dette er en standardprotokol til behandling og opbevaring af blodprøver til downstream flydende biopsiapplikationer baseret på cirkulerende frit DNA. Dette er den første standardprotokol, der offentliggøres, selvom teknikken har været i brug i flere år. Det er let at følge med standardudstyr, der er tilgængeligt i de fleste translationelle eller videnskabelige laboratorier.Protokollen kan udføres af alt laboratoriepersonale. Protokollen hjælper med at standardisere, hvordan vi indsamler og opbevarer prøver, hvilket i sidste ende vil påvirke klinikken og reducere variabiliteten mellem forskellige centre, der udfører den samme eller lignende downstream-analyse, hvor præcision er af største betydning. Denne metode er særlig nyttig i onkologisk forskning og også i kliniske applikationer.Det kan dog også anvendes i andre ikke-kræftsygdomme, hvor den flydende biopsi også anvendes. Efter at blodprøven er blevet centrifugeret, kan det være svært at vide, hvor meget plasma eller serum der skal fjernes, men at følge disse specifikke retningslinjer vil hjælpe med dette. Resten af protokollen er meget let at følge med begrænset erfaring i laboratoriet.Demonstrerer proceduren vil være Jorge, en tekniker fra vores laboratorium. Til at begynde med centrifugeres røret indeholdende frisk blod ved stuetemperatur i 10 minutter ved 1600 gange g, med den maksimale pause påført. Fjern forsigtigt røret fra centrifugen.Den øverste fase af serumsupernatanten vil fremstå klar og gullig. Kontroller, om prøven viser tegn på hæmolyse, og registrer tilstedeværelsen af hæmolyse, når det er relevant. I et klasse II biosikkerhedsskab overføres serumet til opsamlingsrør som 250 mikroliter alikvoter.Aliquoterne skal mærkes korrekt. Frys straks serumet lodret i opbevaringsboksen ved minus 80 grader Celsius, og registrer tidspunktet for prøveopbevaring. Kontroller, at prøverne blev behandlet inden for den krævede tidsramme på fire timer.Centrifuge EDTA-røret ved stuetemperatur i 10 minutter ved 1600 gange g, med den maksimale pause påført. Efter centrifugering vil plasmasupernatanten fremstå klar og gullig. Kontroller, om prøven viser tegn på hæmolyse, og overfør plasmaet til et 15 milliliter centrifugerør uden at forstyrre det cellulære lag ved hjælp af en engangsserologisk pipette.Efterlad et lille resterende volumen plasma over cellelaget på cirka fem millimeter. Hvis hæmolyse observeres, kasseres prøven til yderligere analyse. Centrifuge plasmaet og et 15 milliliter centrifugerør for at fjerne eventuelle resterende intakte blodlegemer, der overføres fra det første centrifugeringstrin.Fjern forsigtigt røret fra centrifugen, ikke cellepelleten i bunden af røret, og overfør en til fire milliliter plasma til en til fire milliliter polypropylen kryogene bios eller Eppendorfs ved hjælp af en engangsserologisk pipette. Et resterende volumen plasma skal efterlades i bunden af røret for at undgå at forurene plasmaet med blodlegemer. Frys straks plasmaet lodret i opbevaringsboksen ved minus 80 grader Celsius, og registrer tidspunktet for prøveopbevaring.Kontroller, at prøverne er korrekt mærket og blev behandlet inden for den krævede tidsramme på fire timer. Saml det cellulære lag ved hjælp af en P1000 og filtreret spids og overfør den til et to milliliter rør. Frys straks og opbevar ved minus 80 grader Celsius.Et eksempel på cfDNA-ekstraktion af høj kvalitet, der kan bruges til downstream-applikationer, er vist her, mens dette grafiske billede repræsenterer et eksempel på en uegnet prøve med et højt niveau af genomisk forurening. Plasma- eller serumfraktionen skal have en gul farve. Dette kan variere afhængigt af den enkelte prøve.Prøver med hæmolyse skal kasseres. Pas på ikke at fjerne nogen cellepellet, når du fjerner plasmafraktionen. Denne protokol kan også anvendes til andre nukleinsyrebaserede og proteinapplikationer, såsom påvisning af ikke-kodende RNA'er eller proteiner i serum- og plasmaprøver ved hjælp af immundetektionsteknikker.Dette er en meget standard teknik, der anvendes i mange laboratorier. Denne protokol hjælper forskere med at standardisere, hvordan vi udfører vores analyse, da dette er et afgørende aspekt, der er nødvendigt for fremtidige kliniske applikationer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MikroRNA baseret flydende biopsi: Oplevelsen af Plasma miRNA signatur klassificering (MSC) til lunge Cancer Screening

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Kendetegner DNA reparationsprocesser på forbigående og langvarig dobbelt-strenget DNA pauser ved immunfluorescens mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Vurdering af gennemførlighed, sikkerhed og nøjagtighed af et intraoperativ højintensive fokuseret ultralyd enhed til behandling af lever metastaser

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinel Intravital Imaging af hjerne tumor celle adfærd som reaktion på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation af cirkulerende tumor celler til downstream Molekylær analyse og metastatisk potentiel vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Imaging af DNA-skader og reparation Foci i Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Automatiseret dissektionsprotokol til tumorberigelse i væv med lavt tumorindhold

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...