Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

We willen het Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) bedanken voor hun steun en de volgende projectsubsidie: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC-platform voor de standaardisatie en promotie van vloeibare biopsie. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Voorafgaande ethische goedkeuring werd verkregen van deelnemende centra vóór de extractie van bloedmonsters. De volgende protocollen voor serum- en plasma-isolatie werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes voor biomedisch onderzoek.
OPMERKING: Voorafgaande overwegingen voordat u met het protocol begint, vindt u hier. Voorafgaande ethische goedkeuring is vereist voor het gebruik van menselijke monsters in biomedisch onderzoek, met de bijbehorende geïnformeerde toestemmin...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

De vloeibare biopsie heeft tal van potentiële toepassingen op verschillende momenten tijdens de behandeling van kanker. Ten eerste, bij diagnose om tumormoleculaire markers te identificeren die de aanwezigheid van een potentiële tumorlaesie zouden suggereren die klinisch verder kan worden onderzocht. Ten tweede, tijdens de behandeling voor real-time monitoring van de ziekte, beoordeling van de moleculaire respons van de behandeling, klonale evolutie en vroege detectie van terugvallen van de ziekte of behandelingsresist...

De term "vloeibare biopsie" werd in 2010gedefinieerd 1 als de aanwezigheid van moleculen (bijv. Eiwit, desoxyribonucleïnezuur (DNA), ribonucleïnezuur (RNA)), cellen of extracellulaire blaasjes (bijv. Exosomen) in bloed en andere lichaamsvloeistoffen die afkomstig zijn van de primaire tumor. Het gebruik van vloeibare biopsiemonsters heeft een revolutie teweeggebracht in translationeel oncologisch onderzoek, omdat weefselbiopten, beperkt tot een bepaald gebied op een bepaald moment, relevante klonen kunnen missen vanwege tumorheterogeniteit. Bovendien speelt vloeibare biopsie een relevante rol bij tumortypen waar primair weefsel schaars of niet toegankelijk is, omdat het een invasieve biopsie kan vermijden, waardoor de kosten en het risico voor patiënten worden verminderd. Bovendien evolueren de moleculaire kenmerken van de tumor voortdurend, voornamelijk als gevolg van de therapiedruk, en vloeibare biopsiemonsters kunnen de tumorklonale dynamiek vastleggen omdat ze longitudinaal kunnen worden genomen, in verschillende klinische en therapeutische tijden van de ziekte, zoals baseline, op behandeling, beste respons en bij ziekteprogressie of zelfs eerder. Het concept van de "real-time vloeibare biopsie" betekent dat dynamische veranderingen in de tumor in realtime kunnen worden gevolgd, waardoor precisiegeneeskunde bij deze ziekte mogelijk is. De vloeibare biopsie heeft tal van potentiële toepassingen in de kliniek, waaronder screening en vroege detectie van kanker, real-time monitoring van de ziekte, detectie van minimale restziekte, het bestuderen van mechanismen voor behandelingsresistentie en stratificatie van patiënten op therapeutisch niveau1. De vroege detectie van ziekterecidief en progressie zijn een onvervulde klinische behoefte bij veel tumortypen en is een belangrijke factor in het verhogen van de overleving en kwaliteit van leven van kankerpatiënten. Routinematige beeldvormingsmodaliteiten en oplosbare tumormarkers kunnen de gevoeligheid en / of specificiteit missen die vereist is voor deze taak. Nieuwe voorspellende markers zijn dus dringend nodig in de kliniek, zoals die op basis van circulerende vrije nucleïnezuren.
De soorten monsters die worden gebruikt voor vloeibare biopsiestudies omvatten maar zijn niet beperkt tot bloed-, urine-, speeksel- en ontlastingsmonsters. Andere tumorspecifieke monsters kunnen celaspiraten, hersenvocht, pleuravocht, cyste- en ascitesvloeistof, sputum en pancreassapzijn 2. De voormalige vloeistoffen kunnen verschillende soorten van kanker afgeleide materialen, circulerende tumorcellen (CTC) of fragmenten zoals exosomen en celvrij circulerend tumor-DNA (ctDNA) bevatten. Nucleïnezuren kunnen worden ingekapseld in extracellulaire blaasjes (EV's) of vrijkomen in lichaamsvloeistoffen als gevolg van celdood en schade. Circulerend vrij DNA (cfDNA) wordt voornamelijk vrijgegeven in de bloedbaan vanuit apoptotische of necrotische cellen en is aanwezig in alle individuen, met verhoogde niveaus bij ontstekings- of oncologische ziekten3. Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes (~ 30-150 nm) uitgescheiden door cellen die nucleïnezuren, eiwitten en lipiden bevatten. Deze blaasjes maken deel uit van het intercellulaire communicatienetwerk en worden vaak aangetroffen in vele soorten lichaamsvloeistoffen2. De nucleïnezuren in EV's worden beschermd tegen de ruwe omgeving in lichaamsvloeistoffen, waardoor een robuustere manier is om deze moleculen in de vloeibare biopsie-instelling te bestuderen.
Over het algemeen zijn de niveaus van circulerende nucleïnezuren in vloeibare biopsiemonsters erg laag en daarom zijn gevoelige methoden nodig voor detectie, zoals digitale PCR of next-generation sequencing (NGS). Preanalytisch beheer van het monster is cruciaal om bloedcellysis en afgifte van intact DNA te voorkomen, waardoor besmetting van het cfDNA met het genomische DNA ontstaat. Bovendien moet bij het extraheren van monsters voorzichtig worden om de aanwezigheid van remmers van op enzymen gebaseerde analysemethoden te voorkomen.
Hier presenteren we een gestandaardiseerde methode voor het verzamelen en opslaan van plasma- en serummonsters, wat een cruciale eerste stap is voor downstream-toepassingen op basis van vloeibare biopsie, inclusief circulerende nucleïnezuuranalyses.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

De term vloeibare biopsie (LB) verwijst naar moleculen zoals eiwitten, DNA, RNA, cellen of extracellulaire blaasjes in bloed en andere lichaamsvloeistoffen die afkomstig zijn van de primaire en / of gemetastaseerde tumor. LB is naar voren gekomen als een steunpilaar in translationeel onderzoek en is begonnen deel uit te maken van de klinische oncologiepraktijk, en biedt een minimaal invasief alternatief voor solide biopsie. De LB maakt real-time monitoring van een tumor mogelijk via een minimaal invasieve monsterextractie, zoals bloed. De toepassingen omvatten vroege detectie van kanker, follow-up van patiënten voor de detectie van ziekteprogressie, beoordeling van minimale restziekte en potentiële identificatie van moleculaire progressie en resistentiemechanisme. Om een betrouwbare analyse van deze monsters te bereiken die in de kliniek kan worden gerapporteerd, moeten de preanalytische procedures zorgvuldig worden overwogen en strikt worden gevolgd. Monsterverzameling, kwaliteit en opslag zijn cruciale stappen die hun nut in downstream-toepassingen bepalen. Hier presenteren we gestandaardiseerde protocollen van onze vloeibare biopsiewerkmodule voor het verzamelen, verwerken en opslaan van plasma- en serummonsters voor downstream vloeibare biopsieanalyse op basis van circulerend vrij DNA. De hier gepresenteerde protocollen vereisen standaardapparatuur en zijn voldoende flexibel om te worden toegepast in de meeste laboratoria die gericht zijn op biologische procedures.

Na centrifugering van de bloedbuizen zonder antistollingsmiddel lijkt de bovenste fase lichtgeel en komt overeen met de serumfractie (figuur 2). Deze fractie wordt zorgvuldig verwijderd en gealiquoteerd voor latere analyse.
Hemolyse kan aanwezig zijn in het plasma of de serumfractie en de bovenste fase zal een roodachtig uiterlijk hebben, wat wijst op de aanwezigheid en mate van hemolyse (figuur 3).
Na cent...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

De vloeibare biopsie heeft een revolutie teweeggebracht in onze benadering van oncologische translationele studies, waarbij monsterverzameling, kwaliteit en opslag cruciale stappen zijn voor de succesvolle klinische toepassing ervan. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd en gevalideerd protocol voor downstream circulerende DNA-toepassingen die in de meeste translationele onderzoekslaboratoria kunnen worden toegepast.

Een gestandaardiseerd preanalytisch protocol voor vloeibare biopsie voor downstream circulerende DNA-toepassingen

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Dit is een standaardprotocol voor de verwerking en opslag van bloedmonsters voor downstream vloeibare biopsietoepassingen op basis van circulerend vrij DNA. Dit is het eerste standaardprotocol dat wordt gepubliceerd, hoewel de techniek al enkele jaren in gebruik is. Het is gemakkelijk te volgen met standaardapparatuur die beschikbaar is in de meeste translationele of wetenschappelijke laboratoria.Het protocol kan door alle laboratoriummedewerkers worden uitgevoerd. Het protocol helpt bij het standaardiseren van de manier waarop we monsters verzamelen en opslaan, wat uiteindelijk van invloed zal zijn op de kliniek en de variabiliteit zal verminderen tussen verschillende centra die dezelfde of vergelijkbare downstream-analyse uitvoeren, waarbij precisie van het grootste belang is. Deze methode is vooral nuttig in oncologisch onderzoek en ook in klinische toepassingen.Het kan echter ook worden toegepast bij andere niet-kankerziekten waarbij de vloeibare biopsie ook wordt gebruikt. Nadat het bloedmonster is gecentrifugeerd, kan het moeilijk zijn om te weten hoeveel plasma of serum moet worden verwijderd, maar het volgen van deze specifieke richtlijnen zal hierbij helpen. De rest van het protocol is zeer eenvoudig te volgen met beperkte ervaring in het laboratorium.Jorge, een technicus van ons laboratorium, demonstreert de procedure. Om te beginnen, centrifugeer de buis met vers bloed bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 1600 keer g, met de maximale pauze toegepast. Verwijder de buis voorzichtig uit de centrifuge.De bovenste fase van het serumsupernatant ziet er helder en gelig uit. Controleer of het monster tekenen van hemolyse vertoont en noteer indien nodig de aanwezigheid van hemolyse. Breng het serum in een bioveiligheidskast van klasse II over naar verzamelbuizen als aliquots van 250 microliter.De aliquots moeten correct worden geëtiketteerd. Vries het serum onmiddellijk rechtop in de bewaardoos bij min 80 graden Celsius en noteer de tijd van opslag van het monster. Controleer of de monsters binnen de vereiste periode van vier uur zijn verwerkt.Centrifugeer de EDTA-buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 1600 maal g, met de maximale pauze toegepast. Na centrifugatie zal het plasma-supernatant helder en geelachtig lijken. Controleer of het monster tekenen van hemolyse vertoont en breng het plasma over naar een centrifugebuis van 15 milliliter zonder de cellaag te verstoren met behulp van een wegwerp serologische pipet.Laat een klein restvolume plasma boven de cellaag achter op ongeveer vijf millimeter. Als hemolyse wordt waargenomen, gooit u het monster weg voor verdere analyse. Centrifugeer het plasma en een centrifugebuis van 15 milliliter om eventuele resterende intacte bloedcellen te verwijderen die zijn overgedragen van de eerste centrifugatiestap.Verwijder voorzichtig de buis uit de centrifuge, niet de celpellet aan de onderkant van de buis, en breng één tot vier milliliter plasma over naar één tot vier milliliter polypropyleen cryogene bios of Eppendorfs met behulp van een wegwerp serologische pipet. Een restvolume plasma moet aan de onderkant van de buis worden achtergelaten om besmetting van het plasma met bloedcellen te voorkomen. Vries het plasma onmiddellijk rechtop in de opslagdoos bij min 80 graden Celsius en noteer de tijd van monsteropslag.Controleer of de monsters correct zijn gelabeld en binnen de vereiste periode van vier uur zijn verwerkt. Verzamel de cellaag met behulp van een P1000 en gefilterde punt en breng deze over naar een buis van twee milliliter. Onmiddellijk invriezen en bewaren bij min 80 graden Celsius.Een voorbeeld van een hoogwaardige cfDNA-extractie die kan worden gebruikt voor downstream-toepassingen wordt hier getoond, terwijl dit grafische beeld een voorbeeld is van een ongeschikt monster met een hoog niveau van genomische verontreiniging. Het plasma of de serumfractie moet een gele kleur hebben. Dit kan variëren afhankelijk van de individuele steekproef.Monsters met hemolyse moeten worden weggegooid. Zorg ervoor dat u geen celpellet verwijdert bij het verwijderen van de plasmafractie. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor andere op nucleïnezuur gebaseerde en eiwittoepassingen, zoals de detectie van niet-coderende RNA's of eiwitten in serum- en plasmamonsters met behulp van immunodetectietechnieken.Dit is een zeer standaard techniek die in veel laboratoria wordt gebruikt. Dit protocol helpt onderzoekers om te standaardiseren hoe we onze analyse uitvoeren, omdat dit een cruciaal aspect is, noodzakelijk voor toekomstige klinische toepassingen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA gebaseerde vloeibare biopsie: De ervaring van de Plasma miRNA handtekening classificatie (MSC) voor Lung Cancer Screening

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Evaluatie van de haalbaarheid, veiligheid en nauwkeurigheid van een intraoperatieve High-intensity gericht echografie apparaat voor de behandeling van lever metastasen

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Geautomatiseerd dissectieprotocol voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...