Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
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Nous tenons à remercier le Réseau de recherche biomédicale sur le cancer (CIBERONC) pour son soutien et la subvention de projet suivante: LB CIBERONC PLATFORM: Plate-forme CIBERONC pour la normalisation et la promotion de la biopsie liquide. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Une approbation éthique préalable a été obtenue auprès des centres participants avant l’extraction des échantillons de sang. Les protocoles suivants pour l’isolement du sérum et du plasma ont été réalisés conformément aux principes éthiques de la recherche biomédicale.
REMARQUE: Les considérations préalables avant de commencer le protocole sont fournies ici. Une approbation éthique préalable est requise pour l’utilisation d’échantillons humains dans la recherche biom...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. 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Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

La biopsie liquide a de nombreuses applications potentielles à différents moments de la prise en charge du cancer. Tout d’abord, au moment du diagnostic, identifier les marqueurs moléculaires tumoraux qui suggéreraient la présence d’une lésion tumorale potentielle qui pourrait faire l’objet d’une étude clinique plus approfondie. Deuxièmement, pendant le traitement pour la surveillance en temps réel de la maladie, l’évaluation de la réponse moléculaire du traitement, l’évolution clonale et la dét...

Le terme « biopsie liquide » a été défini en 20101 comme la présence de molécules (p. ex. protéines, acide désoxyribonucléique (ADN), acide ribonucléique (ARN)), de cellules ou de vésicules extracellulaires (p. ex., exosomes) dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire. L’utilisation d’échantillons de biopsie liquide a révolutionné la recherche translationnelle en oncologie, car les biopsies tissulaires, limitées à une région particulière à un moment donné, peuvent manquer des clones pertinents en raison de l’hétérogénéité tumorale. En outre, la biopsie liquide joue un rôle important dans les types de tumeurs où le tissu primaire est rare ou inaccessible, car elle peut éviter une biopsie invasive, réduisant ainsi les coûts et les risques pour les patients. En outre, les caractéristiques moléculaires de la tumeur évoluent constamment principalement en raison de la pression thérapeutique, et les échantillons de biopsie liquide peuvent capturer la dynamique clonale de la tumeur car ils peuvent être prélevés longitudinalement, à différents moments cliniques et thérapeutiques de la maladie tels que la ligne de base, le traitement, la meilleure réponse et à la progression de la maladie ou même avant. Le concept de « biopsie liquide en temps réel » signifie que les changements dynamiques dans la tumeur peuvent être surveillés en temps réel, permettant ainsi une médecine de précision dans cette maladie. La biopsie liquide a de nombreuses applications potentielles en clinique, notamment le dépistage et la détection précoce du cancer, la surveillance en temps réel de la maladie, la détection de la maladie résiduelle minimale, l’étude des mécanismes de résistance au traitement et la stratification des patients au niveau thérapeutique1. La détection précoce de la récurrence et de la progression de la maladie est un besoin clinique non satisfait dans de nombreux types de tumeurs et est un facteur clé dans l’augmentation de la survie et de la qualité de vie des patients atteints de cancer. Les modalités d’imagerie de routine et les marqueurs tumoraux solubles peuvent manquer de la sensibilité et / ou de la spécificité requises pour cette tâche. Ainsi, de nouveaux marqueurs prédictifs sont nécessaires de toute urgence en clinique, tels que ceux basés sur les acides nucléiques libres circulants.
Les types d’échantillons utilisés pour les études de biopsie liquide comprennent, sans toutefois s’y limiter, des échantillons de sang, d’urine, de salive et de selles. D’autres échantillons spécifiques à la tumeur peuvent être des aspirateurs cellulaires, du liquide céphalo-rachidien, du liquide pleural, du liquide kystique et ascite, des expectorations et du suc pancréatique2. Les premiers liquides peuvent contenir différents types de matériaux dérivés du cancer, des cellules tumorales circulantes (CTC) ou des fragments tels que des exosomes et de l’ADN tumoral circulant sans cellules (ADNct). Les acides nucléiques peuvent être encapsulés dans des vésicules extracellulaires (VE) ou libérés dans les fluides corporels en raison de la mort cellulaire et des dommages. L’ADN libre circulant (cfDNA) est principalement libéré dans la circulation sanguine par les cellules apoptotiques ou nécrotiques et est présent chez tous les individus, montrant des niveaux accrus dans les maladies inflammatoires ou oncologiques3. Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires (~30-150 nm) sécrétées par des cellules contenant des acides nucléiques, des protéines et des lipides. Ces vésicules font partie du réseau de communication intercellulaire et se trouvent couramment dans de nombreux types de fluides corporels2. Les acides nucléiques enfermés à l’intérieur des VE sont protégés de l’environnement hostile dans les fluides corporels, offrant ainsi un moyen plus robuste d’étudier ces molécules dans le cadre de la biopsie liquide.
Dans l’ensemble, les niveaux d’acides nucléiques circulants dans les échantillons de biopsie liquide sont très faibles et, par conséquent, des méthodes sensibles sont nécessaires pour la détection, telles que la PCR numérique ou le séquençage de nouvelle génération (NGS). La gestion préanalytique de l’échantillon est cruciale pour prévenir la lyse des cellules sanguines et la libération d’ADN intact, provoquant une contamination de l’ADNf par l’ADN génomique. En outre, des précautions doivent être prises lors de l’extraction des échantillons pour éviter la présence d’inhibiteurs des méthodes d’analyse à base d’enzymes.
Nous présentons ici une méthode standardisée pour la collecte et le stockage d’échantillons de plasma et de sérum, qui est une première étape cruciale pour les applications en aval basées sur la biopsie liquide, y compris les analyses d’acides nucléiques circulants.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

Le terme biopsie liquide (LB) fait référence à des molécules telles que les protéines, l’ADN, l’ARN, les cellules ou les vésicules extracellulaires dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire et / ou métastatique. LB est devenu un pilier de la recherche translationnelle et a commencé à faire partie de la pratique clinique en oncologie, offrant une alternative mini-invasive à la biopsie solide. Le LB permet la surveillance en temps réel d’une tumeur via une extraction d’échantillon mini-invasive, comme le sang. Les applications comprennent la détection précoce du cancer, le suivi des patients pour la détection de la progression de la maladie, l’évaluation de la maladie résiduelle minimale et l’identification potentielle de la progression moléculaire et du mécanisme de résistance. Afin d’obtenir une analyse fiable de ces échantillons qui peut être rapportée en clinique, les procédures préanalytiques doivent être soigneusement examinées et strictement suivies. La collecte, la qualité et le stockage des échantillons sont des étapes cruciales qui déterminent leur utilité dans les applications en aval. Nous présentons ici des protocoles standardisés de notre module de travail de biopsie liquide pour la collecte, le traitement et le stockage d’échantillons de plasma et de sérum pour l’analyse de biopsie liquide en aval basée sur de l’ADN sans circulation. Les protocoles présentés ici nécessitent un équipement standard et sont suffisamment flexibles pour être appliqués dans la plupart des laboratoires axés sur les procédures biologiques.

Après centrifugation des tubes sanguins sans anticoagulant, la phase supérieure apparaît jaune pâle et correspond à la fraction sérique (Figure 2). Cette fraction est soigneusement enlevée et alicitée pour une analyse ultérieure.
L’hémolyse peut être présente dans la fraction plasmatique ou sérique, et la phase supérieure aura un aspect rougeâtre, ce qui indique la présence et le degré d’hémolyse (Figure 3).
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A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

La biopsie liquide a révolutionné notre approche des études translationnelles en oncologie, la collecte, la qualité et le stockage des échantillons étant des étapes cruciales pour son application clinique réussie. Nous décrivons ici un protocole standardisé et validé pour les applications d’ADN libre circulant en aval qui peut être appliqué dans la plupart des laboratoires de recherche translationnelle.

Un protocole préanalytique normalisé de biopsie liquide pour les applications d’ADN libre circulant en aval

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Il s’agit d’un protocole standard pour le traitement et le stockage d’échantillons de sang pour les applications de biopsie liquide en aval basées sur l’ADN libre circulant. Il s’agit du premier protocole standard publié, bien que la technique soit utilisée depuis plusieurs années. Il est facile à suivre avec l’équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires translationnels ou scientifiques.Le protocole peut être exécuté par tout le personnel du laboratoire. Le protocole aide à normaliser la façon dont nous prélevons et stockons les échantillons, ce qui aura un impact final sur la clinique et réduira la variabilité entre les différents centres effectuant la même analyse en aval ou une analyse similaire où la précision est de la plus haute importance. Cette méthode est particulièrement utile dans la recherche en oncologie et aussi dans les applications cliniques.Cependant, il peut également être appliqué dans d’autres maladies non cancéreuses où la biopsie liquide est également utilisée. Une fois que l’échantillon de sang a été centrifugé, il peut être difficile de savoir combien de plasma ou de sérum à éliminer, mais suivre ces directives spécifiques vous aidera. Le reste du protocole est très facile à suivre avec une expérience limitée en laboratoire.La démonstration de la procédure sera assurée par Jorge, un technicien de notre laboratoire. Pour commencer, centrifuger le tube contenant du sang frais à température ambiante pendant 10 minutes à 1600 fois g, en appliquant la cassure maximale. Retirez délicatement le tube de la centrifugeuse.La phase supérieure du surnageant sérique apparaîtra claire et jaunâtre. Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse et notez la présence d’hémolyse le cas échéant. Dans une enceinte de biosécurité de classe II, transférer le sérum dans des tubes de prélèvement sous forme d’aliquotes de 250 microlitres.Les aliquotes doivent être correctement étiquetées. Congelez immédiatement le sérum à la verticale dans la boîte de stockage à moins 80 degrés Celsius et notez le temps de stockage de l’échantillon. Vérifier que les échantillons ont été traités dans le délai requis de quatre heures.Centrifuger le tube EDTA à température ambiante pendant 10 minutes à 1600 fois g, en appliquant la rupture maximale. Après centrifugation, le surnageant plasmatique apparaîtra clair et jaunâtre. Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse et transférez le plasma dans un tube centrifuge de 15 millilitres sans perturber la couche cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique jetable.Laissez un petit volume résiduel de plasma au-dessus de la couche cellulaire à environ cinq millimètres. Si une hémolyse est observée, jeter l’échantillon pour une analyse plus approfondie. Centrifuger le plasma et un tube de centrifugation de 15 millilitres pour éliminer les cellules sanguines intactes résiduelles rapportées de la première étape de centrifugation.Retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse, pas la pastille de cellule au fond du tube, et transférez un à quatre millilitres de plasma dans un à quatre millilitres de polypropylène bios cryogéniques ou Eppendorfs à l’aide d’une pipette sérologique jetable. Un volume résiduel de plasma doit être laissé au fond du tube pour éviter de contaminer le plasma avec des cellules sanguines. Congelez immédiatement le plasma à la verticale dans la boîte de stockage à moins 80 degrés Celsius et notez le temps de stockage de l’échantillon.Vérifiez que les échantillons sont correctement étiquetés et ont été traités dans le délai requis de quatre heures. Collectez la couche cellulaire à l’aide d’un P1000 et d’une pointe filtrée et transférez-la dans un tube de deux millilitres. Congeler immédiatement et conserver à moins 80 degrés Celsius.Un exemple d’extraction d’ADNcf de haute qualité pouvant être utilisée pour des applications en aval est présenté ici, alors que cette image graphique représente un exemple d’échantillon inapproprié avec un niveau élevé de contamination génomique. La fraction plasmatique ou sérique doit être de couleur jaune. Cela peut varier en fonction de l’échantillon individuel.Les échantillons avec hémolyse doivent être jetés. Veillez à ne pas enlever de pastille cellulaire lors de l’élimination de la fraction plasmatique. Ce protocole peut également être utilisé pour d’autres applications à base d’acides nucléiques et de protéines, telles que la détection d’ARN ou de protéines non codants dans des échantillons de sérum et de plasma à l’aide de techniques d’immunodétection.Il s’agit d’une technique très courante utilisée dans de nombreux laboratoires. Ce protocole aide les chercheurs à normaliser la façon dont nous effectuons notre analyse, car il s’agit d’un aspect crucial, nécessaire pour de futures applications cliniques.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Recherche

Recherche en cancérologie

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