Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

ברצוננו להודות לרשת המחקר הביו-רפואי בסרטן (CIBERONC) על תמיכתם ועל מענק הפרויקט הבא: LB CIBERONC PLATFORM: פלטפורמת CIBERONC לתקנון וקידום ביופסיה נוזלית. PI רודריגו טולדו, (CIBERONC), 2019-2021.

אישור אתי מוקדם התקבל מהמרכזים המשתתפים לפני הפקת דגימות הדם. הפרוטוקולים הבאים לבידוד סרום ופלזמה בוצעו בהתאם לעקרונות האתיים למחקר ביו-רפואי.
הערה: שיקולים קודמים לפני תחילת הפרוטוקול מובאים כאן. נדרש אישור אתי מוקדם לשימוש בדגימות אנושיות במחקר ביו-רפואי, בהסכמה מדעת מ?...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

לביופסיה הנוזלית יש יישומים פוטנציאליים רבים בזמנים שונים במהלך ניהול הסרטן. ראשית, באבחון כדי לזהות סמנים מולקולריים של גידולים שיצביעו על נוכחות של נגע פוטנציאלי בגידול שעשוי להיחקר עוד יותר מבחינה קלינית. שנית, במהלך הטיפול לניטור בזמן אמת של המחלה, הערכת התגובה המולקולרית של הטיפול, ?...

המונח "ביופסיה נוזלית" הוגדר בשנת 20101 כנוכחות של מולקולות (למשל, חלבון, חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA), חומצה ריבונוקלאית (RNA)), תאים או שלפוחיות חוץ-תאיות (למשל, אקסוזומים) בדם ובנוזלי גוף אחרים שמקורם בגידול הראשוני. השימוש בדגימות ביופסיה נוזלית חולל מהפכה במחקר האונקולוגי התרגומי, שכן ביופסיות רקמות, המוגבלות לאזור מסוים ברגע מסוים, עלולות להחמיץ שיבוטים רלוונטיים בשל הטרוגניות הגידול. בנוסף, ביופסיה נוזלית ממלאת תפקיד רלוונטי בסוגי גידולים שבהם הרקמה הראשונית נדירה או אינה נגישה, שכן היא עשויה למנוע ביופסיה פולשנית, ולהפחית עלויות וסיכון לחולים. יתר על כן, המאפיינים המולקולריים של הגידול מתפתחים ללא הרף בעיקר בשל לחץ הטיפול, ודגימות ביופסיה נוזליות יכולות ללכוד את הדינמיקה הקלונלית של הגידול כפי שניתן לקחת אותן לאורך, בזמנים קליניים וטיפוליים שונים של המחלה כגון בסיס, על הטיפול, על הטיפול, התגובה הטובה ביותר, ובהתקדמות המחלה או אפילו לפני כן. הרעיון של "ביופסיה נוזלית בזמן אמת" פירושו שניתן לעקוב אחר שינויים דינמיים בגידול בזמן אמת, ובכך לאפשר רפואה מדויקת במחלה זו. לביופסיה הנוזלית יש יישומים פוטנציאליים רבים במרפאה, כולל סינון וגילוי מוקדם של סרטן, ניטור בזמן אמת של המחלה, זיהוי מחלה שיורית מינימלית, חקר מנגנונים לעמידות לטיפול וריבוד חולים ברמה הטיפולית1. הגילוי המוקדם של הישנות המחלה והתקדמותה הם צורך קליני שלא קיבל מענה בסוגי גידולים רבים ומהווים גורם מפתח בהגדלת ההישרדות ואיכות החיים של חולי סרטן. שיטות הדמיה שגרתיות וסמני גידול מסיסים עשויים להיות חסרים את הרגישות ו/או הספציפיות הנדרשות למשימה זו. לפיכך, יש צורך דחוף בסמני חיזוי חדשניים במרפאה, כגון אלה המבוססים על הפצת חומצות גרעין חופשיות במחזור הדם.
סוגי הדגימות המשמשות למחקרי ביופסיה נוזלית כוללים, בין היתר, דגימות דם, שתן, רוק וצואה. דגימות אחרות הספציפיות לגידול יכולות להיות שאיפות תאים, נוזל מוחי, נוזל pleural, נוזל ציסטה ומיימת, כיח ומיץ לבלב2. הנוזלים הראשונים עשויים להכיל סוגים שונים של חומרים שמקורם בסרטן, תאי גידול במחזור הדם (CTC), או שברים כגון אקסוזומים ודנ"א גידולי במחזור ללא תאים (ctDNA). חומצות גרעין עשויות להיות עטופות בשלפוחיות חוץ-תאיות (רכבים חשמליים) או להשתחרר לנוזלי הגוף עקב מוות ונזק לתאים. דנ"א חופשי במחזור הדם (cfDNA) משתחרר בעיקר לזרם הדם מתאים אפופטוטיים או נמקיים ונמצא בכל האנשים, ומראה רמות מוגברות במחלות דלקתיות או אונקולוגיות3. אקסוזומים הם בועיות חוץ-תאיות קטנות (כ-30-150 ננומטר) המופרשות על-ידי תאים המכילים חומצות גרעין, חלבונים וליפידים. שלפוחיות אלה מהוות חלק מרשת התקשורת הבין-תאית והן נמצאות בדרך כלל בסוגים רבים של נוזלי גוף2. חומצות הגרעין הסגורות בתוך כלי רכב חשמליים מוגנות מפני הסביבה הקשה בנוזלי הגוף, ובכך מספקות דרך איתנה יותר לחקור את המולקולות הללו במסגרת הביופסיה הנוזלית.
באופן כללי, הרמות של חומצות גרעין במחזור הדם בדגימות ביופסיה נוזלית נמוכות מאוד, ולכן יש צורך בשיטות רגישות לזיהוי, כגון PCR דיגיטלי או ריצוף מהדור הבא (NGS). ניהול פרה-אנליטי של הדגימה הוא חיוני כדי למנוע תזה של תאי דם ושחרור של דנ"א שלם, מה שגורם לזיהום של ה-cfDNA עם הדנ"א הגנומי. יתר על כן, יש לנקוט משנה זהירות בעת חילוץ דגימות כדי למנוע נוכחות של מעכבים של שיטות ניתוח מבוססות אנזימים.
כאן אנו מציגים שיטה מתוקננת לאיסוף ואחסון של דגימות פלזמה וסרום, המהווה צעד ראשון מכריע עבור יישומים מבוססי ביופסיה נוזלית במורד הזרם, כולל ניתוחי חומצות גרעין במחזור הדם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

המונח ביופסיה נוזלית (LB) מתייחס למולקולות כגון חלבונים, דנ"א, רנ"א, רנ"א, תאים או שלפוחיות חוץ-תאיות בדם ובנוזלי גוף אחרים שמקורם בגידול הראשוני ו/או הגרורתי. LB התגלתה כעמוד תווך במחקר תרגומי והחלה להפוך לחלק מהפרקטיקה האונקולוגית הקלינית, המספקת חלופה זעיר פולשנית לביופסיה מוצקה. ה- LB מאפשר ניטור בזמן אמת של גידול באמצעות מיצוי דגימה זעיר פולשנית, כגון דם. היישומים כוללים גילוי מוקדם של סרטן, מעקב אחר מטופלים לגילוי התקדמות המחלה, הערכה של מחלה שיורית מינימלית, וזיהוי פוטנציאלי של התקדמות מולקולרית ומנגנון עמידות. על מנת להשיג ניתוח אמין של דגימות אלה שניתן לדווח עליהן במרפאה, יש לשקול בזהירות את ההליכים הקדם-אנליטיים ולעקוב בקפדנות. איסוף דגימות, איכות ואחסון הם שלבים חיוניים שקובעים את התועלת שלהם ביישומים במורד הזרם. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים סטנדרטיים ממודול העבודה שלנו בביופסיה נוזלית לאיסוף, עיבוד ואחסון דגימות פלזמה וסרום לניתוח ביופסיה נוזלית במורד הזרם בהתבסס על דנ"א ללא מחזור הדם. הפרוטוקולים המוצגים כאן דורשים ציוד סטנדרטי והם גמישים מספיק כדי להיות מיושמים ברוב המעבדות המתמקדות בהליכים ביולוגיים.

לאחר צנטריפוגה של צינורות הדם ללא נוגדי קרישה, הפאזה העליונה נראית צהובה בהירה ומתאימה לשבר הסרום (איור 2). חלק זה מוסר בקפידה ומועבר לניתוח הבא.
המוליזה עשויה להיות נוכחת בחלק הפלזמה או הסרום, והפאזה העליונה תהיה בעלת מראה אדמדם, מה שמעיד על נוכחות ומידת ההמו...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

הביופסיה הנוזלית חוללה מהפכה בגישה שלנו למחקרים תרגומיים אונקולוגיים, כאשר איסוף הדגימות, האיכות והאחסון היוו שלבים מכריעים ליישום הקליני המוצלח שלה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מתוקנן ומאומת ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם, שניתן ליישם ברוב מעבדות המחקר התרגומיות.

פרוטוקול קדם-אנליטי של ביופסיה נוזלית סטנדרטית ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

זהו פרוטוקול סטנדרטי לעיבוד ואחסון של דגימות דם עבור יישומי ביופסיה נוזלית במורד הזרם המבוססים על דנ"א חופשי במחזור. זהו הפרוטוקול הסטנדרטי הראשון שפורסם, אם כי הטכניקה נמצאת בשימוש כבר מספר שנים. קל לעקוב אחריו עם ציוד סטנדרטי הזמין ברוב המעבדות התרגומיות או המדעיות.הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי כל צוות המעבדה. הפרוטוקול עוזר לתקנן את האופן שבו אנו אוספים ומאחסנים דגימות, מה שבסופו של דבר ישפיע במרפאה ויפחית את השונות בין מרכזים שונים המבצעים ניתוח זהה או דומה במורד הזרם, כאשר הדיוק הוא בעל חשיבות עליונה. שיטה זו שימושית במיוחד במחקר אונקולוגי וגם ביישומים קליניים.עם זאת, זה עשוי להיות מיושם גם במחלות אחרות שאינן סרטניות שבו ביופסיה נוזלית משמש גם. לאחר דגימת הדם כבר צנטריפוגה, לדעת כמה פלזמה או סרום להסיר יכול להיות קשה, אבל בעקבות הנחיות ספציפיות זה יעזור עם זה. שאר הפרוטוקול קל מאוד למעקב עם ניסיון מוגבל במעבדה.מי שידגים את ההליך יהיה חורחה, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, צנטריפוגה הצינור המכיל דם טרי בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 1600 פעמים גרם, עם הפסקה מקסימלית מוחל. הסר בזהירות את הצינור מהצנטריפוגה.השלב העליון של הסרום supernatant ייראה ברור וצהבהב. בדוק אם הדגימה מראה סימנים של המוליזה ולרשום את נוכחות המוליזה בעת הצורך. בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II, העבירו את הסרום לצינורות איסוף כ-250 מיקרוליטר אליקוטים.האליקוטים חייבים להיות מסומנים כהלכה. הקפיאו מיד את הסרום זקוף בקופסת האחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס, ותעדו את זמן האחסון לדוגמה. ודא שהדגימות עובדו במסגרת הזמן הנדרשת של ארבע שעות.צנטריפוגה של צינור EDTA בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 1600 פעמים גרם, עם הפסקה מקסימלית מוחל. לאחר צנטריפוגה, הפלזמה supernatant ייראה ברור וצהבהב. בדוק אם הדגימה מראה סימנים של המוליזה והעבר את הפלזמה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר מבלי להפריע לשכבת התאים באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית.השאירו נפח שיורי קטן של פלזמה מעל שכבת התא בערך חמישה מילימטרים. אם המוליזה הוא ציין, להשליך את המדגם לניתוח נוסף. צנטריפוגה את הפלזמה וצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר כדי להסיר את שאריות תאי הדם השלמים הנישאים משלב הצנטריפוגה הראשון.הסר בזהירות את הצינור מהצנטריפוגה, לא את כדור התא בתחתית הצינור, והעבר אחד עד ארבעה מיליליטר של פלזמה לפוליפרופילן קריוגני אחד עד ארבעה מיליליטר או אפנדורף באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית. נפח שיורי של פלזמה חייב להישאר בתחתית הצינור כדי למנוע זיהום הפלזמה עם תאי הדם. מיד להקפיא את הפלזמה זקופה בקופסת האחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס, ולרשום את זמן אחסון הדגימה.ודא שהדגימות מסומנות כהלכה ועובדו במסגרת הזמן הנדרשת של ארבע שעות. אסוף את השכבה התאית באמצעות P1000 וקצה מסונן והעבר אותה לצינור של שני מיליליטר. מיד להקפיא ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.דוגמה למיצוי cfDNA באיכות גבוהה שניתן להשתמש בו ליישומים במורד הזרם מוצגת כאן, בעוד שתמונה גרפית זו מייצגת דוגמה לדגימה לא מתאימה עם רמה גבוהה של זיהום גנומי. חלק הפלזמה או הסרום חייב להיות בצבע צהוב. הדבר עשוי להשתנות בהתאם לדוגמה הספציפית.דגימות עם המוליזה יש להשליך. היזהר לא להסיר כל כדור התא בעת הסרת חלק פלזמה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם ליישומים אחרים המבוססים על חומצות גרעין וחלבונים, כגון זיהוי של רנ"א שאינם מקודדים או חלבונים בדגימות סרום ופלזמה באמצעות טכניקות לזיהוי חיסון.זוהי טכניקה סטנדרטית מאוד המשמשת במעבדות רבות. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים לתקנן את האופן שבו אנו מבצעים את הניתוח שלנו מכיוון שזהו היבט מכריע, הנחוץ ליישומים קליניים עתידיים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA מבוסס נוזלי ביופסיה: החוויה של miRNA פלזמה החתימה מסווג (MSC) לסינון סרטן ריאות

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

הערכה של כדאיות, בטיחות, דיוק בעצימות גבוהה פוסט מרוכז מכשיר אולטרסאונד לטיפול גרורות בכבד

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...