Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

हम उनके समर्थन और निम्नलिखित परियोजना अनुदान के लिए कैंसर में बायोमेडिकल रिसर्च नेटवर्क (सीआईबेरॉन्क) को धन्यवाद देना चाहते हैं: एलबी सीआईबेरॉन्क प्लेटफॉर्म: तरल बायोप्सी के मानकीकरण और प्रचार के लिए सीआईबीरॉन्क प्लेटफॉर्म। पीआई रोड्रिगो टोलेडो, (सीआईबीईआरओएनसी), 2019-2021।

रक्त के नमूनों के निष्कर्षण से पहले भाग लेने वाले केंद्रों से पूर्व नैतिक अनुमोदन प्राप्त किया गया था। सीरम और प्लाज्मा अलगाव के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए नैतिक सिद्धांत?...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

कैंसर के प्रबंधन के दौरान तरल बायोप्सी में अलग-अलग समय पर कई संभावित अनुप्रयोग होते हैं। सबसे पहले, ट्यूमर आणविक मार्करों की पहचान करने के लिए निदान पर जो संभावित ट्यूमर घाव की उपस्थिति का सुझाव देगा ज?...

शब्द "तरल बायोप्सी" को 20101 में अणुओं (जैसे, प्रोटीन, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए), राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए)), कोशिकाओं, या बाह्य पुटिकाओं (जैसे, एक्सोसोम) की उपस्थिति के रूप में परिभाषित किया गया था रक्त और अन्य शारीरिक तरल पदार्थ जो प्राथमिक ट्यूमर से उत्पन्न होते हैं। तरल बायोप्सी नमूनों के उपयोग ने ट्रांसलेशनल ऑन्कोलॉजी अनुसंधान में क्रांति ला दी है क्योंकि ऊतक बायोप्सी, एक विशेष क्षण में एक विशेष क्षेत्र तक सीमित है, ट्यूमर विषमता के कारण प्रासंगिक क्लोन को याद कर सकती है। इसके अलावा, तरल बायोप्सी ट्यूमर प्रकारों में एक प्रासंगिक भूमिका निभाती है जहां प्राथमिक ऊतक दुर्लभ है या सुलभ नहीं है, क्योंकि यह आक्रामक बायोप्सी से बच सकता है, जिससे रोगियों के लिए लागत और जोखिम कम हो सकता है। इसके अलावा, ट्यूमर आणविक विशेषताएं लगातार मुख्य रूप से चिकित्सा दबाव के कारण विकसित हो रही हैं, और तरल बायोप्सी नमूने ट्यूमर क्लोनल गतिशीलता को पकड़ सकते हैं क्योंकि उन्हें अनुदैर्ध्य रूप से लिया जा सकता है, रोग के विभिन्न नैदानिक और चिकित्सीय समय जैसे बेसलाइन, उपचार पर, सर्वोत्तम प्रतिक्रिया, और रोग की प्रगति पर या इससे पहले भी। "वास्तविक समय तरल बायोप्सी" की अवधारणा का अर्थ है कि ट्यूमर में गतिशील परिवर्तनों की वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है, इस प्रकार इस बीमारी में सटीक दवा की अनुमति मिलती है। क्लिनिक में तरल बायोप्सी के कई संभावित अनुप्रयोग हैं, जिनमें कैंसर की स्क्रीनिंग और शुरुआती पहचान, बीमारी की वास्तविक समय की निगरानी, न्यूनतम अवशिष्ट रोग का पता लगाना, उपचार प्रतिरोध के लिए तंत्र का अध्ययन करना और चिकित्सीय स्तर पर रोगियों का स्तरीकरणशामिल है। रोग पुनरावृत्ति और प्रगति का प्रारंभिक पता लगाना कई ट्यूमर प्रकारों में एक अपूर्ण नैदानिक आवश्यकता है और कैंसर रोगियों के अस्तित्व और जीवन की गुणवत्ता को बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण कारक है। नियमित इमेजिंग तौर-तरीकों और घुलनशील ट्यूमर मार्करों में इस कार्य के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और / इस प्रकार, क्लिनिक में उपन्यास भविष्य कहनेवाला मार्करों की तत्काल आवश्यकता होती है, जैसे कि मुक्त न्यूक्लिक एसिड परिसंचारी पर आधारित।
तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों के प्रकारों में शामिल हैं लेकिन रक्त, मूत्र, लार और मल के नमूनों तक सीमित नहीं हैं। अन्य ट्यूमर-विशिष्ट नमूने सेल एस्पिरेट्स, मस्तिष्कमेरु द्रव, फुफ्फुस द्रव, पुटी और जलोदर द्रव, थूक और अग्नाशयी रस हो सकते हैं2. पूर्व तरल पदार्थों में विभिन्न प्रकार के कैंसर-व्युत्पन्न सामग्री, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी), या एक्सोसोम और सेल-फ्री परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (सीटीडीएनए) जैसे टुकड़े हो सकते हैं। न्यूक्लिक एसिड को बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) में समझाया जा सकता है या कोशिका मृत्यु और क्षति के कारण शरीर के तरल पदार्थों में जारी किया जा सकता है। परिसंचारी मुक्त डीएनए (सीएफडीएनए) मुख्य रूप से एपोप्टोटिक या नेक्रोटिक कोशिकाओं से रक्तप्रवाह में जारी किया जाता है और सभी व्यक्तियों में मौजूद होता है, जो भड़काऊ या ऑन्कोलॉजिकल बीमारियों में वृद्धि के स्तर को दर्शाता है3. एक्सोसोम छोटे बाह्य पुटिकाएं (~ 30-150 एनएम) हैं जो न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और लिपिड युक्त कोशिकाओं द्वारा स्रावित होती हैं। ये पुटिकाएं अंतरकोशिकीय संचार नेटवर्क का हिस्सा बनती हैं और आमतौर पर कई प्रकार के शरीर के तरल पदार्थों में पाई जाती हैं2. ईवीएस के अंदर संलग्न न्यूक्लिक एसिड शारीरिक तरल पदार्थों के भीतर कठोर वातावरण से संरक्षित होते हैं, इस प्रकार तरल बायोप्सी सेटिंग में इन अणुओं का अध्ययन करने का एक अधिक मजबूत तरीका प्रदान करते हैं।
कुल मिलाकर, तरल बायोप्सी नमूनों में परिसंचारी न्यूक्लिक एसिड का स्तर बहुत कम है, और इसलिए पता लगाने के लिए संवेदनशील तरीकों की आवश्यकता होती है, जैसे कि डिजिटल पीसीआर या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस)। नमूने का पूर्वविश्लेषणात्मक प्रबंधन रक्त कोशिका लसीका को रोकने और बरकरार डीएनए की रिहाई को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे जीनोमिक डीएनए के साथ सीएफडीएनए का संदूषण होता है। इसके अलावा, एंजाइम-आधारित विश्लेषण विधियों के अवरोधकों की उपस्थिति से बचने के लिए नमूने निकालते समय देखभाल की जानी चाहिए।
यहां हम प्लाज्मा और सीरम नमूनों के संग्रह और भंडारण के लिए एक मानकीकृत विधि प्रस्तुत करते हैं, जो तरल बायोप्सी-आधारित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है, जिसमें परिसंचारी न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण शामिल हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

तरल बायोप्सी (एलबी) शब्द प्रोटीन, डीएनए, आरएनए, कोशिकाओं या रक्त में बाह्य पुटिकाओं और अन्य शारीरिक तरल पदार्थों जैसे अणुओं को संदर्भित करता है जो प्राथमिक और / एलबी ट्रांसलेशनल रिसर्च में एक मुख्य आधार के रूप में उभरा है और नैदानिक ऑन्कोलॉजी अभ्यास का हिस्सा बनना शुरू कर दिया है, जो ठोस बायोप्सी के लिए न्यूनतम इनवेसिव विकल्प प्रदान करता है। एलबी रक्त जैसे न्यूनतम इनवेसिव नमूना निष्कर्षण के माध्यम से ट्यूमर की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है। अनुप्रयोगों में प्रारंभिक कैंसर का पता लगाना, रोग प्रगति का पता लगाने के लिए रोगी अनुवर्ती, न्यूनतम अवशिष्ट रोग का मूल्यांकन और आणविक प्रगति की संभावित पहचान और प्रतिरोध का तंत्र शामिल है। क्लिनिक में रिपोर्ट किए जा सकने वाले इन नमूनों का एक विश्वसनीय विश्लेषण प्राप्त करने के लिए, पूर्वविश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए और कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। नमूना संग्रह, गुणवत्ता और भंडारण महत्वपूर्ण कदम हैं जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उनकी उपयोगिता निर्धारित करते हैं। यहां, हम परिसंचारी मुक्त डीएनए के आधार पर डाउनस्ट्रीम तरल बायोप्सी विश्लेषण के लिए प्लाज्मा और सीरम नमूनों को इकट्ठा करने, प्रसंस्करण और संग्रहीत करने के लिए हमारे तरल बायोप्सी वर्किंग मॉड्यूल से मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मानक उपकरणों की आवश्यकता होती है और जैविक प्रक्रियाओं पर केंद्रित अधिकांश प्रयोगशालाओं में लागू होने के लिए पर्याप्त रूप से लचीले होते हैं।

थक्कारोधी के बिना रक्त ट्यूबों के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ऊपरी चरण एक हल्का पीला दिखाई देता है और सीरम अंश (चित्रा 2) से मेल खाता है। इस अंश को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है और बाद के विश्लेष?...

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A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

तरल बायोप्सी ने ऑन्कोलॉजी ट्रांसलेशनल अध्ययन के लिए हमारे दृष्टिकोण में क्रांति ला दी है, नमूना संग्रह, गुणवत्ता और भंडारण इसके सफल नैदानिक अनुप्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। यहां हम डाउनस्ट्रीम परिसंचारी मुक्त डीएनए अनुप्रयोगों के लिए एक मानकीकृत और मान्य प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसे अधिकांश अनुवादक अनुसंधान प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है।

डाउनस्ट्रीम परिसंचारी मुक्त डीएनए अनुप्रयोगों के लिए एक मानकीकृत तरल बायोप्सी प्रीएनालिटिकल प्रोटोकॉल

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

यह मुक्त डीएनए परिसंचारी के आधार पर डाउनस्ट्रीम तरल बायोप्सी अनुप्रयोगों के लिए रक्त के नमूनों के प्रसंस्करण और भंडारण के लिए एक मानक प्रोटोकॉल है। यह प्रकाशित पहला मानक प्रोटोकॉल है, हालांकि तकनीक कई वर्षों से उपयोग में है। अधिकांश अनुवादक या वैज्ञानिक प्रयोगशालाओं में उपलब्ध मानक उपकरणों के साथ पालन करना आसान है।प्रोटोकॉल सभी प्रयोगशाला कर्मचारियों द्वारा किया जा सकता है। प्रोटोकॉल मानकीकृत करने में मदद करता है कि हम नमूने कैसे एकत्र करते हैं और संग्रहीत करते हैं, जो अंततः क्लिनिक में प्रभाव डालेगा और समान या समान डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करने वाले विभिन्न केंद्रों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करेगा जहां परिशुद्धता सबसे अधिक महत्व की है। यह विधि ऑन्कोलॉजी अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों में भी विशेष रूप से उपयोगी है।हालांकि, इसे अन्य गैर-कैंसर रोगों में भी लागू किया जा सकता है जहां तरल बायोप्सी का भी उपयोग किया जाता है। रक्त के नमूने को सेंट्रीफ्यूज करने के बाद, यह जानना कि कितना प्लाज्मा या सीरम निकालना मुश्किल हो सकता है, लेकिन इस विशिष्ट दिशानिर्देशों का पालन करने से इसमें मदद मिलेगी। बाकी प्रोटोकॉल प्रयोगशाला में सीमित अनुभव के साथ पालन करना बहुत आसान है।प्रक्रिया का प्रदर्शन जॉर्ज, हमारी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा। शुरू करने के लिए, कमरे के तापमान पर ताजा रक्त युक्त ट्यूब को 1600 गुना जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें, अधिकतम ब्रेक लागू करने के साथ। ध्यान से अपकेंद्रित्र से ट्यूब को हटा दें।सीरम सतह पर तैरनेवाला का ऊपरी चरण स्पष्ट और पीला दिखाई देगा। जांचें कि क्या नमूना हेमोलिसिस के संकेत दिखाता है और उचित होने पर हेमोलिसिस की उपस्थिति दर्ज करता है। कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में, सीरम को 250-माइक्रोलीटर विभाज्य के रूप में संग्रह ट्यूबों में स्थानांतरित करें।विभाज्य को सही ढंग से लेबल किया जाना चाहिए। तुरंत माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोरेज बॉक्स में सीरम को सीधे फ्रीज करें, और नमूना भंडारण के समय को रिकॉर्ड करें। सत्यापित करें कि नमूने आवश्यक चार घंटे की समय सीमा के भीतर संसाधित किए गए थे।अधिकतम ब्रेक लागू होने के साथ, 1600 गुना जी पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ईडीटीए ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्लाज्मा सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट और पीला दिखाई देगा। जांचें कि क्या नमूना हेमोलिसिस के संकेत दिखाता है और डिस्पोजेबल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सेलुलर परत को परेशान किए बिना प्लाज्मा को 15-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करता है।लगभग पांच मिलीमीटर पर सेल परत के ऊपर प्लाज्मा की एक छोटी अवशिष्ट मात्रा छोड़ दें। यदि हेमोलिसिस मनाया जाता है, तो आगे के विश्लेषण के लिए नमूने को त्याग दें। पहले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण से किए गए किसी भी अवशिष्ट बरकरार रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए प्लाज्मा और 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें।ध्यान से अपकेंद्रित्र से ट्यूब को हटा दें, ट्यूब के तल पर सेल गोली नहीं, और एक डिस्पोजेबल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्लाज्मा के एक से चार मिलीलीटर को एक से चार मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन क्रायोजेनिक बायोस या एपेंडॉर्फ में स्थानांतरित करें। प्लाज्मा की अवशिष्ट मात्रा को रक्त कोशिकाओं के साथ प्लाज्मा को दूषित करने से बचने के लिए ट्यूब के तल पर छोड़ दिया जाना चाहिए। तुरंत माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोरेज बॉक्स में प्लाज्मा को सीधे फ्रीज करें, और नमूना भंडारण के समय को रिकॉर्ड करें।सत्यापित करें कि नमूने सही ढंग से लेबल किए गए हैं और आवश्यक चार घंटे की समय सीमा के भीतर संसाधित किए गए थे। पी 1000 और फ़िल्टर टिप का उपयोग करके सेलुलर परत को इकट्ठा करें और इसे दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। तुरंत फ्रीज करें और शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे स्टोर करें।एक उच्च गुणवत्ता वाले सीएफडीएनए निष्कर्षण का एक उदाहरण जिसका उपयोग डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, यहां दिखाया गया है, जबकि यह ग्राफिकल छवि उच्च स्तर के जीनोमिक संदूषण के साथ अनुपयुक्त नमूने का एक उदाहरण दर्शाती है। प्लाज्मा या सीरम अंश एक पीला रंग होना चाहिए। यह व्यक्तिगत नमूने के आधार पर भिन्न हो सकता है।हेमोलिसिस वाले नमूनों को त्याग दिया जाना चाहिए। प्लाज्मा अंश को हटाते समय किसी भी सेल गोली को हटाने के लिए सावधान रहें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य न्यूक्लिक एसिड आधारित और प्रोटीन अनुप्रयोगों के लिए भी किया जा सकता है, जैसे इम्यूनो डिटेक्शन तकनीकों का उपयोग करके सीरम और प्लाज्मा नमूनों में गैर-कोडिंग आरएनए या प्रोटीन का पता लगाना।यह कई प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली एक बहुत ही मानक तकनीक है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को मानकीकृत करने में मदद करता है कि हम अपना विश्लेषण कैसे करते हैं क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण पहलू है, जो भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

फैलाना आंतरिक Pontine Glioma की रैपिड पोस्टमार्टम सेल संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA आधारित तरल बायोप्सी: फेफड़ों के कैंसर स्क्रीनिंग के लिए प्लाज्मा miRNA हस्ताक्षर वर्गीकारक (एमएससी) का अनुभव

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

लक्ष्य सेल पूर्व संवर्धन और पूरे जीनोम प्रवर्धन एकल कोशिका बहाव लक्षण वर्णन के लिए

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

ऊपर की ओर बढ़ रहा है: एक सरल और लचीले इन विट्रो में तीन आयामी आक्रमण परख प्रोटोकॉल

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा क्षणिक और लंबे समय से स्थायी डबल-किनारा डीएनए टूटता में निस्र्पक डीएनए की मरंमत की प्रक्रिया

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

व्यवहार्यता का मूल्यांकन, सुरक्षा, और एक Intraoperative उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड डिवाइस की सटीकता जिगर मेटास्टेसिस के इलाज के लिए

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

एक इनवेसिव सर्जिकल बायोप्सी के जवाब में मस्तिष्क ट्यूमर सेल व्यवहार के दीर्घकालिक Intravital इमेजिंग

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

अनुप्रवाह आण्विक विश्लेषण और मेटास्टेटिक संभावित मूल्यांकन के लिए परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के micromanipulation

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

मानव पेट के कैंसर कोशिकाओं में डीएनए क्षति और मरम्मत Foci के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

कम ट्यूमर सामग्री ऊतकों में ट्यूमर संवर्धन के लिए स्वचालित विच्छेदन प्रोटोकॉल

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...