Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

Vorremmo ringraziare la Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) per il loro sostegno e la seguente sovvenzione di progetto: LB CIBERONC PLATFORM: piattaforma CIBERONC per la standardizzazione e la promozione della biopsia liquida. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

La previa approvazione etica è stata ottenuta dai centri partecipanti prima dell'estrazione dei campioni di sangue. I seguenti protocolli per l'isolamento del siero e del plasma sono stati eseguiti in conformità con i principi etici per la ricerca biomedica.
NOTA: le considerazioni preliminari prima di iniziare il protocollo sono fornite qui. È necessaria una previa approvazione etica per l'uso di campioni umani nella ricerca biomedica, con il corrispondente consenso informato. Per gestire ...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

La biopsia liquida ha numerose potenziali applicazioni in momenti diversi durante la gestione del cancro. In primo luogo, alla diagnosi per identificare i marcatori molecolari tumorali che suggerirebbero la presenza di una potenziale lesione tumorale che potrebbe essere ulteriormente studiata clinicamente. In secondo luogo, durante il trattamento per il monitoraggio in tempo reale della malattia, la valutazione della risposta molecolare del trattamento, l'evoluzione clonale e la diagnosi precoce delle recidive della mala...

Il termine "biopsia liquida" è stato definito nel 20101 come la presenza di molecole (ad esempio, proteine, acido desossiribonucleico (DNA), acido ribonucleico (RNA)), cellule o vescicole extracellulari (ad esempio, esosomi) nel sangue e in altri fluidi corporei che provengono dal tumore primario. L'uso di campioni di biopsia liquida ha rivoluzionato la ricerca oncologica traslazionale in quanto le biopsie tissutali, limitate a una particolare regione in un particolare momento, possono perdere cloni rilevanti a causa dell'eterogeneità del tumore. Inoltre, la biopsia liquida svolge un ruolo rilevante nei tipi di tumore in cui il tessuto primario è scarso o non accessibile, in quanto può evitare una biopsia invasiva, riducendo i costi e i rischi per i pazienti. Inoltre, le caratteristiche molecolari del tumore sono in continua evoluzione principalmente a causa della pressione della terapia, e i campioni di biopsia liquida possono catturare la dinamica clonale del tumore in quanto possono essere prelevati longitudinalmente, in diversi momenti clinici e terapeutici della malattia come al basale, al trattamento, alla migliore risposta e alla progressione della malattia o anche prima. Il concetto di "biopsia liquida in tempo reale" significa che i cambiamenti dinamici nel tumore possono essere monitorati in tempo reale, consentendo così la medicina di precisione in questa malattia. La biopsia liquida ha numerose potenziali applicazioni in clinica, tra cui lo screening e la diagnosi precoce del cancro, il monitoraggio in tempo reale della malattia, il rilevamento della malattia residua minima, lo studio dei meccanismi di resistenza al trattamento e la stratificazione dei pazienti a livello terapeutico1. La diagnosi precoce della recidiva e della progressione della malattia è un'esigenza clinica insoddisfatta in molti tipi di tumore ed è un fattore chiave per aumentare la sopravvivenza e la qualità della vita dei malati di cancro. Le modalità di imaging di routine e i marcatori tumorali solubili possono non avere la sensibilità e / o la specificità richieste per questo compito. Pertanto, nuovi marcatori predittivi sono urgentemente necessari nella clinica, come quelli basati su acidi nucleici liberi circolanti.
I tipi di campioni utilizzati per gli studi di biopsia liquida includono, ma non sono limitati a sangue, urina, saliva e campioni di feci. Altri campioni specifici del tumore possono essere aspirati cellulari, liquido cerebrospinale, liquido pleurico, liquido di cisti e ascite, espettorato e succo pancreatico2. I primi liquidi possono contenere diversi tipi di materiali derivati dal cancro, cellule tumorali circolanti (CTC) o frammenti come esosomi e DNA tumorale circolante privo di cellule (ctDNA). Gli acidi nucleici possono essere incapsulati in vescicole extracellulari (EV) o rilasciati nei fluidi corporei a causa della morte e del danno cellulare. Il DNA libero circolante (cfDNA) viene rilasciato principalmente nel flusso sanguigno da cellule apoptotiche o necrotiche ed è presente in tutti gli individui, mostrando livelli aumentati nelle malattie infiammatorie o oncologiche3. Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari (~ 30-150 nm) secrete da cellule contenenti acidi nucleici, proteine e lipidi. Queste vescicole fanno parte della rete di comunicazione intercellulare e si trovano comunemente in molti tipi di fluidi corporei2. Gli acidi nucleici racchiusi all'interno dei veicoli elettrici sono protetti dall'ambiente ostile all'interno dei fluidi corporei, fornendo così un modo più robusto per studiare queste molecole nell'ambiente della biopsia liquida.
Nel complesso, i livelli di acidi nucleici circolanti nei campioni di biopsia liquida sono molto bassi e quindi sono necessari metodi sensibili per il rilevamento, come la PCR digitale o il sequenziamento di nuova generazione (NGS). La gestione preanalitica del campione è fondamentale per prevenire la lisi delle cellule del sangue e il rilascio di DNA intatto, causando la contaminazione del cfDNA con il DNA genomico. Inoltre, è necessario prestare attenzione durante l'estrazione dei campioni per evitare la presenza di inibitori dei metodi di analisi basati su enzimi.
Qui presentiamo un metodo standardizzato per la raccolta e lo stoccaggio di campioni di plasma e siero, che è un primo passo cruciale per le applicazioni a valle basate sulla biopsia liquida, comprese le analisi degli acidi nucleici circolanti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

Il termine biopsia liquida (LB) si riferisce a molecole come proteine, DNA, RNA, cellule o vescicole extracellulari nel sangue e altri fluidi corporei che provengono dal tumore primario e / o metastatico. LB è emerso come un pilastro nella ricerca traslazionale e ha iniziato a diventare parte della pratica oncologica clinica, fornendo un'alternativa minimamente invasiva alla biopsia solida. L'LB consente il monitoraggio in tempo reale di un tumore tramite un'estrazione del campione minimamente invasiva, come il sangue. Le applicazioni includono la diagnosi precoce del cancro, il follow-up del paziente per il rilevamento della progressione della malattia, la valutazione della malattia residua minima e la potenziale identificazione della progressione molecolare e del meccanismo di resistenza. Al fine di ottenere un'analisi affidabile di questi campioni che può essere riportata in clinica, le procedure preanalitiche devono essere attentamente considerate e rigorosamente seguite. La raccolta, la qualità e l'archiviazione dei campioni sono passaggi cruciali che ne determinano l'utilità nelle applicazioni a valle. Qui, presentiamo protocolli standardizzati dal nostro modulo di lavoro per biopsia liquida per la raccolta, l'elaborazione e la conservazione di campioni di plasma e siero per l'analisi della biopsia liquida a valle basata sul DNA privo di circolazione. I protocolli qui presentati richiedono attrezzature standard e sono sufficientemente flessibili da essere applicati nella maggior parte dei laboratori focalizzati su procedure biologiche.

Dopo la centrifugazione delle provette del sangue senza anticoagulante, la fase superiore appare di un giallo pallido e corrisponde alla frazione sierica (Figura 2). Questa frazione viene accuratamente rimossa e aliquotata per un'analisi successiva.
L'emolisi può essere presente sia nel plasma che nella frazione sierica e la fase superiore avrà un aspetto rossastro, che indica la presenza e il grado di emolisi (Figura 3).
<p cla...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

La biopsia liquida ha rivoluzionato il nostro approccio agli studi traslazionali oncologici, con la raccolta, la qualità e lo stoccaggio dei campioni come passaggi cruciali per la sua applicazione clinica di successo. Qui descriviamo un protocollo standardizzato e convalidato per applicazioni di DNA senza circolazione a valle che può essere applicato nella maggior parte dei laboratori di ricerca traslazionale.

Un protocollo preanalitico standardizzato per biopsia liquida per applicazioni di DNA libero da circolazione a valle

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Si tratta di un protocollo standard per l'elaborazione e la conservazione di campioni di sangue per applicazioni di biopsia liquida a valle basate su DNA libero circolante. Questo è il primo protocollo standard pubblicato, anche se la tecnica è in uso da diversi anni. È facile da seguire con le attrezzature standard disponibili nella maggior parte dei laboratori traslazionali o scientifici.Il protocollo può essere eseguito da tutto il personale di laboratorio. Il protocollo aiuta a standardizzare il modo in cui raccogliamo e conserviamo i campioni, il che alla fine avrà un impatto sulla clinica e ridurrà la variabilità tra i diversi centri che eseguono analisi a valle uguali o simili in cui la precisione è della massima importanza. Questo metodo è particolarmente utile nella ricerca oncologica e anche nelle applicazioni cliniche.Tuttavia, può anche essere applicato in altre malattie non tumorali in cui viene utilizzata anche la biopsia liquida. Dopo che il campione di sangue è stato centrifugato, sapere quanto plasma o siero rimuovere può essere difficile, ma seguire queste linee guida specifiche aiuterà in questo. Il resto del protocollo è molto facile da seguire con un'esperienza limitata in laboratorio.A dimostrare la procedura sarà Jorge, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare, centrifugare la provetta contenente sangue fresco a temperatura ambiente per 10 minuti a 1600 volte g, con la massima rottura applicata. Rimuovere con cautela il tubo dalla centrifuga.La fase superiore del surnatante sierico apparirà chiara e giallastra. Controllare se il campione mostra segni di emolisi e registrare la presenza di emolisi quando appropriato. In un armadio di biosicurezza di classe II, trasferire il siero in provette di raccolta come aliquote da 250 microlitri.Le aliquote devono essere etichettate correttamente. Congelare immediatamente il siero in posizione verticale nella scatola di conservazione a meno 80 gradi Celsius e registrare il tempo di conservazione del campione. Verificare che i campioni siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di quattro ore.Centrifugare il tubo EDTA a temperatura ambiente per 10 minuti a 1600 volte g, con la massima rottura applicata. Dopo la centrifugazione, il surnatante plasmatico apparirà chiaro e giallastro. Controllare se il campione mostra segni di emolisi e trasferire il plasma in una provetta da centrifuga da 15 millilitri senza disturbare lo strato cellulare utilizzando una pipetta sierologica monouso.Lasciare un piccolo volume residuo di plasma sopra lo strato cellulare a circa cinque millimetri. Se si osserva emolisi, scartare il campione per ulteriori analisi. Centrifugare il plasma e una provetta da centrifuga da 15 millilitri per rimuovere eventuali cellule del sangue intatte residue riportate dalla prima fase di centrifugazione.Rimuovere con cautela il tubo dalla centrifuga, non il pellet cellulare sul fondo del tubo, e trasferire da uno a quattro millilitri di plasma a bios criogenico in polipropilene da uno a quattro millilitri o Eppendorfs utilizzando una pipetta sierologica monouso. Un volume residuo di plasma deve essere lasciato sul fondo della provetta per evitare di contaminare il plasma con le cellule del sangue. Congelare immediatamente il plasma in posizione verticale nella scatola di stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e registrare il tempo di conservazione del campione.Verificare che i campioni siano etichettati correttamente e siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di quattro ore. Raccogliere lo strato cellulare utilizzando un P1000 e una punta filtrata e trasferirlo in un tubo da due millilitri. Congelare immediatamente e conservare a meno 80 gradi Celsius.Un esempio di estrazione di cfDNA di alta qualità che può essere utilizzato per applicazioni a valle è mostrato qui, mentre questa immagine grafica rappresenta un esempio di un campione non adatto con un alto livello di contaminazione genomica. La frazione plasmatica o sierica deve essere di colore giallo. Questo può variare a seconda del singolo campione.I campioni con emolisi devono essere scartati. Fare attenzione a non rimuovere alcun pellet cellulare quando si rimuove la frazione plasmatica. Questo protocollo può essere utilizzato anche per altre applicazioni basate su acidi nucleici e proteine, come la rilevazione di RNA o proteine non codificanti in campioni di siero e plasma utilizzando tecniche di rilevamento immunologico.Questa è una tecnica molto standard utilizzata in molti laboratori. Questo protocollo aiuta i ricercatori a standardizzare il modo in cui eseguiamo le nostre analisi in quanto questo è un aspetto cruciale, necessario per le future applicazioni cliniche.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA biopsia liquida di base: L'esperienza del Plasma quieto firma classificatore (MSC) per lo Screening del cancro del polmone

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Valutazione di fattibilità, la sicurezza e la precisione di un'intraoperatoria ad alta intensità focalizzato dispositivo a ultrasuoni per il trattamento di metastasi epatiche

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imaging intravitale longitudinale del comportamento delle cellule tumorali cerebrali in risposta a una biopsia chirurgica invasiva

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Protocollo di dissezione automatizzato per l'arricchimento tumorale nei tessuti a basso contenuto tumorale

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...