Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
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我々は、がんの生物医学研究ネットワーク(CIBERONC)の支援と、次のプロジェクト助成金に感謝したいと思います:LB CIBERONCプラットフォーム:リキッドバイオプシーの標準化と促進のためのシベロンクプラットフォーム。PI ロドリゴ・トレド, (CIBERONC), 2019-2021.

血液サンプルの抽出前に、参加センターから事前の倫理的承認が得られました。血清および血漿単離のための以下のプロトコールは、生物医学研究のための倫理的原則に従って実施された。
メモ: プロトコルを開始する前の事前の考慮事項については、こちらを参照してください。生物医学研究におけるヒトサンプルの使用には、対応するインフォームドコンセントとと...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. 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Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

リキッドバイオプシーは、癌の管理中の異なる時期に多数の潜在的な用途を有する。第一に、診断時に、臨床的にさらに調査される可能性のある潜在的な腫瘍病変の存在を示唆する腫瘍分子マーカーを同定する。第二に、治療中に疾患のリアルタイムモニタリング、治療分子応答の評価、クローン進化、および疾患再発または治療抵抗性の早期発見を行う。最後に、外科的処置の後、最小限?...

用語「リキッドバイオプシー」は、2010年1 月に、原発腫瘍に由来する血液および他の体液中の分子(例えば、タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA))、細胞、または細胞外小胞(例えば、エキソソーム)の存在として定義された。リキッドバイオプシーサンプルの使用は、組織生検としてのトランスレーショナル腫瘍学研究に革命をもたらしており、特定の瞬間に特定の領域に限定され、腫瘍の不均一性のために関連するクローンを見逃す可能性がある。さらに、リキッドバイオプシーは、侵襲的な生検を回避し、患者のコストとリスクを軽減する可能性があるため、一次組織が乏しい、またはアクセスできない腫瘍タイプにおいて適切な役割を果たします。さらに、腫瘍分子特性は、主に治療圧力のために絶えず進化しており、リキッドバイオプシーサンプルは、ベースライン、治療、最良の応答、および疾患の進行時またはそれ以前など、疾患のさまざまな臨床的および治療的時間において、縦方向に採取することができるため、腫瘍クローンダイナミクスを捕捉することができる。「リアルタイムリキッドバイオプシー」の概念は、腫瘍の動的変化をリアルタイムで監視できることを意味し、この疾患における精密医療を可能にする。リキッドバイオプシーは、がんのスクリーニングと早期発見、疾患のリアルタイムモニタリング、最小限の残存疾患の検出、治療抵抗性のメカニズムの研究、治療レベル1での患者の層別化など、診療所で数多くの潜在的な用途があります。疾患の再発および進行の早期発見は、多くの腫瘍タイプにおいて満たされていない臨床的ニーズであり、がん患者の生存率および生活の質を高める上で重要な要素である。日常的な画像化モダリティおよび可溶性腫瘍マーカーは、このタスクに必要な感度および/または特異性を欠いている可能性がある。したがって、循環遊離核酸に基づくものなど、診療所において新規な予測マーカーが緊急に必要とされている。
リキッドバイオプシー研究に使用されるサンプルの種類には、血液、尿、唾液、および便サンプルが含まれますが、これらに限定されません。他の腫瘍特異的試料は、細胞吸引液、脳脊髄液、胸水、嚢胞液および腹水、喀痰、および膵液2であり得る。前者の液体は、異なるタイプの癌由来物質、循環腫瘍細胞(CTC)、またはエキソソームおよび無細胞循環腫瘍DNA(ctDNA)などの断片を含んでもよい。核酸は、細胞外小胞(EV)に封入されるか、または細胞死および損傷のために体液中に放出され得る。循環遊離DNA(cfDNA)は、主にアポトーシス細胞または壊死細胞から血流に放出され、すべての個体に存在し、炎症性または腫瘍学的疾患におけるレベルの増加を示す3。エキソソームは、核酸、タンパク質、および脂質を含む細胞によって分泌される小さな細胞外小胞(〜30〜150nm)である。これらの小胞は、細胞間通信ネットワークの一部を形成し、多くの種類の体液2に一般的に見られる。EV内部に封入された核酸は、体液中の過酷な環境から保護されているため、リキッドバイオプシー環境でこれらの分子を研究するためのより堅牢な方法を提供します。
全体として、リキッドバイオプシーサンプル中の循環核酸のレベルは非常に低いため、デジタルPCRや次世代シーケンシング(NGS)などの検出には高感度な方法が必要です。サンプルの事前分析管理は、血球溶解および無傷のDNAの放出を防ぎ、cfDNAとゲノムDNAの汚染を引き起こすために不可欠です。さらに、サンプルを抽出する際には、酵素ベースの分析方法の阻害剤の存在を避けるために注意する必要があります。
ここでは、循環核酸分析を含むリキッドバイオプシーベースの下流アプリケーションにとって重要な最初のステップである、血漿および血清サンプルの収集と保存のための標準化された方法を紹介します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

リキッドバイオプシー(LB)という用語は、原発性および/または転移性腫瘍に由来する血液および他の体液中のタンパク質、DNA、RNA、細胞、または細胞外小胞などの分子を指す。LBはトランスレーショナルリサーチの柱として浮上し、臨床腫瘍学の実践の一部となり始めており、固形生検に代わる低侵襲の代替手段を提供しています。LBは、血液などの低侵襲サンプル抽出 を介して 腫瘍のリアルタイムモニタリングを可能にします。これらのアプリケーションには、がんの早期発見、疾患進行の検出のための患者フォローアップ、最小限の残存疾患の評価、分子進行および耐性のメカニズムの潜在的な同定が含まれる。診療所で報告できるこれらのサンプルの信頼性の高い分析を達成するためには、分析前の手順を慎重に検討し、厳密に従う必要があります。サンプルの収集、品質、および保管は、ダウンストリームアプリケーションでの有用性を判断する重要なステップです。ここでは、循環のないDNAに基づく下流のリキッドバイオプシー分析のために、血漿および血清サンプルを収集、処理、および保存するための当社のリキッドバイオプシー作業モジュールからの標準化されたプロトコルを紹介します。ここで紹介するプロトコルは、標準的な機器を必要とし、生物学的手順に焦点を当てたほとんどの研究室に適用するのに十分な柔軟性があります。

抗凝固剤を含まない血液チューブの遠心分離後、上相は淡黄色で表示され、血清画分に相当する(図2)。この画分は慎重に除去され、その後の分析のために小分けされます。
溶血は血漿または血清画分のいずれかに存在することができ、上相は赤みを帯びた外観を有し、これは溶血の存在および程度を示す(図3)。
<p class="jove_...

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A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。

下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

これは、循環遊離DNAに基づくダウンストリームリキッドバイオプシーアプリケーション用の血液サンプルの処理と保存のための標準プロトコルです。これは公開された最初の標準プロトコルですが、この手法は数年前から使用されています。ほとんどのトランスレーショナルラボまたは科学ラボで利用可能な標準機器で簡単にフォローできます。プロトコルは、すべてのラボスタッフが実行できます。このプロトコルは、サンプルの収集と保管の方法を標準化するのに役立ち、最終的にはクリニックに影響を与え、精度が最も重要な同じまたは類似のダウンストリーム分析を実行する異なるセンター間のばらつきを減らします。この方法は、腫瘍学研究および臨床応用において特に有用である。ただし、リキッドバイオプシーも使用される他の非癌疾患にも適用できます。血液サンプルを遠心分離した後、除去する血漿または血清の量を知ることは難しい場合がありますが、この特定のガイドラインに従うことはこれに役立ちます。プロトコルの残りの部分は、実験室での経験が限られているため、非常に簡単に理解できます。手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるホルヘです。まず、新鮮な血液を含むチューブを室温で1600倍gで10分間遠心分離し、最大のブレークを適用します。遠心分離機からチューブを慎重に取り外します。血清上清の上相は透明で黄色がかって見えます。サンプルに溶血の兆候が見られるかどうかを確認し、必要に応じて溶血の存在を記録します。クラスIIバイオセーフティキャビネットで、血清を250マイクロリットルのアリコートとして収集チューブに移します。アリコートは正しくラベル付けされている必要があります。すぐに保存ボックス内の血清を摂氏マイナス80度で直立凍結し、サンプル保存時間を記録します。サンプルが必要な 4 時間以内に処理されたことを確認します。EDTAチューブを室温で1600倍gで10分間遠心分離し、最大のブレークを適用します。遠心分離後、血漿上清は透明で黄色がかったように見えます。サンプルに溶血の兆候が見られるかどうかを確認し、使い捨ての血清学的ピペットを使用して細胞層を乱すことなく、血漿を15ミリリットルの遠沈管に移します。細胞層の上に約5ミリメートルの少量の残留血漿を残します。溶血が観察された場合は、さらなる分析のためにサンプルを廃棄してください。血漿と15ミリリットルの遠沈管を遠心分離して、最初の遠心分離ステップから持ち越された残りの無傷の血球を除去します。チューブの下部にある細胞ペレットではなく、遠心分離機からチューブを慎重に取り外し、使い捨ての血清学的ピペットを使用して、1〜4ミリリットルの血漿を1〜4ミリリットルのポリプロピレン極低温BIOSまたはエッペンドルフに移します。血漿が血球で汚染されないように、チューブの底に残留量の血漿を残す必要があります。直ちにマイナス80°Cで保存ボックス内のプラズマを直立凍結し、サンプル保存時間を記録します。サンプルが正しくラベル付けされ、必要な4時間以内に処理されたことを確認します。P1000とろ過されたチップを使用して細胞層を収集し、それを2ミリリットルのチューブに移します。すぐに凍結し、マイナス80°Cで保管してください。ダウンストリームアプリケーションに使用できる高品質のcfDNA抽出の例がここに示されていますが、このグラフィック画像は、高レベルのゲノム汚染を伴う不適切なサンプルの例を表しています。血漿または血清画分は黄色でなければならない。これは、個々のサンプルによって異なる場合があります。溶血のあるサンプルは廃棄する必要があります。血漿画分を除去するときは、細胞ペレットを除去しないように注意してください。.このプロトコルは、免疫検出技術を用いた血清および血漿サンプル中のノンコーディングRNAまたはタンパク質の検出など、他の核酸ベースおよびタンパク質アプリケーションにも使用できます。これは多くの研究室で使用されている非常に標準的な技術です。このプロトコルは、将来の臨床応用に必要な重要な側面であるため、研究者が分析を実行する方法を標準化するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

マイクロ Rna による液体生検: プラズマ miRNA 署名分類 (MSC) がん検診用の経験

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

肝転移の治療に超音波装置が可能性、安全性、術中の高輝度の精度の評価に焦点を当ててください。

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

低腫瘍含量組織における腫瘍濃縮のための自動解剖プロトコル

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...