Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) for deres støtte og følgende prosjektstipend: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC-plattform for standardisering og promotering av flytende biopsi. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Forutgående etisk godkjenning ble innhentet fra deltakende sentre før uttak av blodprøver. Følgende protokoller for serum- og plasmaisolering ble utført i samsvar med etiske prinsipper for biomedisinsk forskning.
MERK: Tidligere vurderinger før du begynner protokollen er gitt her. Etisk forhåndsgodkjenning kreves for bruk av humane prøver i biomedisinsk forskning, med tilsvarende informert samtykke. Et biosikkerhetsskap i klasse II er nødvendig for å håndtere blodprøver. En laborat...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

Den flytende biopsien har mange potensielle anvendelser på forskjellige tidspunkter under behandling av kreft. Først ved diagnose for å identifisere tumormolekylære markører som tyder på tilstedeværelse av en potensiell tumorlesjon som kan undersøkes videre klinisk. For det andre, under behandling for sanntidsovervåking av sykdommen, vurdering av behandlingsmolekylær respons, klonal evolusjon og tidlig påvisning av sykdomsfall eller behandlingsresistens. Til slutt, etter kirurgisk behandling, som et verktøy f...

Begrepet "flytende biopsi" ble definert i2010 1 som tilstedeværelse av molekyler (f.eks. Protein, deoksyribonukleinsyre (DNA), ribonukleinsyre (RNA)), celler eller ekstracellulære vesikler (f.eks. eksosomer) i blod og andre kroppsvæsker som stammer fra den primære svulsten. Bruken av flytende biopsiprøver har revolusjonert translasjonell onkologisk forskning, da vevsbiopsier, begrenset til en bestemt region på et bestemt tidspunkt, kan savne relevante kloner på grunn av tumor heterogenitet. I tillegg spiller flytende biopsi en relevant rolle i tumortyper der primærvev er lite eller ikke tilgjengelig, da det kan unngå en invasiv biopsi, redusere kostnader og risiko for pasienter. Videre utvikler de tumormolekylære egenskapene seg kontinuerlig, hovedsakelig på grunn av terapitrykket, og flytende biopsiprøver kan fange svulsten klonal dynamikk som de kan tas i lengderetningen, i forskjellige kliniske og terapeutiske tider av sykdommen som baseline, på behandling, beste respons, og ved sykdomsprogresjon eller til og med før. Konseptet med "sanntids flytende biopsi" betyr at dynamiske endringer i svulsten kan overvåkes i sanntid, og dermed tillate presisjonsmedisin i denne sykdommen. Væskebiopsien har mange potensielle anvendelser i klinikken, inkludert screening og tidlig påvisning av kreft, sanntidsovervåking av sykdom, påvisning av minimal restsykdom, studier av mekanismer for behandlingsresistens og stratifisering av pasienter på terapeutisk nivå1. Tidlig påvisning av sykdomsresidiv og progresjon er et udekket klinisk behov i mange tumortyper og er en nøkkelfaktor for å øke overlevelsen og livskvaliteten til kreftpasienter. Rutinemessige bildemodaliteter og løselige tumormarkører kan mangle følsomheten og / eller spesifisiteten som kreves for denne oppgaven. Dermed er det presserende behov for nye prediktive markører i klinikken, for eksempel de som er basert på sirkulerende frie nukleinsyrer.
De typer prøver som brukes til flytende biopsi studier inkluderer, men er ikke begrenset til blod, urin, spytt og avføring prøver. Andre tumorspesifikke prøver kan være celleaspirater, cerebrospinalvæske, pleuravæske, cyste og ascitesvæske, sputum og bukspyttkjerteljuice2. De tidligere væskene kan inneholde forskjellige typer kreftavledede materialer, sirkulerende tumorceller (CTC) eller fragmenter som eksosomer og cellefritt sirkulerende tumor-DNA (ctDNA). Nukleinsyrer kan innkapsles i ekstracellulære vesikler (EV) eller slippes ut i kroppsvæsker på grunn av celledød og skade. Sirkulerende fritt DNA (cfDNA) frigjøres hovedsakelig i blodet fra apoptotiske eller nekrotiske celler og er tilstede hos alle individer, og viser økte nivåer i inflammatoriske eller onkologiske sykdommer3. Eksosomer er små ekstracellulære vesikler (~ 30-150 nm) utskilt av celler som inneholder nukleinsyrer, proteiner og lipider. Disse vesiklene er en del av det intercellulære kommunikasjonsnettverket og finnes ofte i mange typer kroppsvæsker. Nukleinsyrene innelukket i EV er beskyttet mot det tøffe miljøet i kroppsvæsker, og gir dermed en mer robust måte å studere disse molekylene i flytende biopsiinnstilling.
Samlet sett er nivåene av sirkulerende nukleinsyrer i flytende biopsiprøver svært lave, og derfor er det nødvendig med følsomme metoder for deteksjon, for eksempel digital PCR eller neste generasjons sekvensering (NGS). Preanalytisk styring av prøven er avgjørende for å forhindre blodcellelyse og frigjøring av intakt DNA, noe som forårsaker forurensning av cfDNA med genomisk DNA. Videre må det utvises forsiktighet ved ekstrahering av prøver for å unngå tilstedeværelse av inhibitorer av enzymbaserte analysemetoder.
Her presenterer vi en standardisert metode for innsamling og lagring av plasma- og serumprøver, som er et avgjørende første skritt for flytende biopsibaserte nedstrømsapplikasjoner, inkludert sirkulerende nukleinsyreanalyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

Begrepet flytende biopsi (LB) refererer til molekyler som proteiner, DNA, RNA, celler eller ekstracellulære vesikler i blod og andre kroppsvæsker som stammer fra den primære og / eller metastatiske svulsten. LB har dukket opp som en bærebjelke i translasjonsforskning og har begynt å bli en del av klinisk onkologisk praksis, noe som gir et minimalt invasivt alternativ til solid biopsi. LB tillater sanntidsovervåking av en svulst via en minimal invasiv prøveekstraksjon, for eksempel blod. Søknadene inkluderer tidlig kreftdeteksjon, pasientoppfølging for påvisning av sykdomsprogresjon, vurdering av minimal restsykdom og potensiell identifisering av molekylær progresjon og resistensmekanisme. For å oppnå en pålitelig analyse av disse prøvene som kan rapporteres i klinikken, bør de preanalytiske prosedyrene vurderes nøye og følges nøye. Prøveinnsamling, kvalitet og lagring er avgjørende trinn som bestemmer nytten i nedstrømsapplikasjoner. Her presenterer vi standardiserte protokoller fra vår flytende biopsi-arbeidsmodul for innsamling, behandling og lagring av plasma- og serumprøver for nedstrøms flytende biopsianalyse basert på sirkulerende fritt DNA. Protokollene som presenteres her krever standardutstyr og er tilstrekkelig fleksible til å brukes i de fleste laboratorier fokusert på biologiske prosedyrer.

Etter sentrifugering av blodrørene uten antikoagulant fremstår overfasen som svakt gul og tilsvarer serumfraksjonen (figur 2). Denne fraksjonen fjernes forsiktig og aliquoteres for senere analyse.
Hemolyse kan være tilstede i enten plasma- eller serumfraksjonen, og den øvre fasen vil ha et rødlig utseende, noe som indikerer tilstedeværelse og grad av hemolyse (figur 3).
Etter sentrifugering av EDTA-r?...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

Den flytende biopsien har revolusjonert vår tilnærming til onkologiske translasjonsstudier, med prøveinnsamling, kvalitet og lagring som avgjørende skritt for vellykket klinisk anvendelse. Her beskriver vi en standardisert og validert protokoll for nedstrøms sirkulasjonsfrie DNA-applikasjoner som kan brukes i de fleste translasjonelle forskningslaboratorier.

En standardisert preanalytisk protokoll for flytende biopsi for nedstrøms sirkulasjonsfrie DNA-applikasjoner

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Dette er en standardprotokoll for behandling og lagring av blodprøver for nedstrøms flytende biopsiapplikasjoner basert på sirkulerende fritt DNA. Dette er den første standardprotokollen som er publisert, selv om teknikken har vært i bruk i flere år. Det er lett å følge med standardutstyr tilgjengelig i de fleste translasjonelle eller vitenskapelige laboratorier.Protokollen kan utføres av alle laboratorieansatte. Protokollen bidrar til å standardisere hvordan vi samler inn og lagrer prøver, noe som til slutt vil påvirke klinikken og redusere variabiliteten mellom ulike sentre som utfører samme eller lignende nedstrømsanalyse der presisjon er av største betydning. Denne metoden er spesielt nyttig i onkologisk forskning og også i kliniske applikasjoner.Det kan imidlertid også brukes i andre ikke-kreftsykdommer der væskebiopsien også brukes. Etter at blodprøven er sentrifugert, kan det være vanskelig å vite hvor mye plasma eller serum som skal fjernes, men å følge disse spesifikke retningslinjene vil hjelpe med dette. Resten av protokollen er veldig enkel å følge med begrenset erfaring i laboratoriet.Demonstrere prosedyren vil være Jorge, en tekniker fra vårt laboratorium. For å begynne, sentrifuger røret som inneholder friskt blod ved romtemperatur i 10 minutter ved 1600 ganger g, med maksimal pause påført. Fjern forsiktig røret fra sentrifugen.Den øvre fasen av serumsupernatanten vil virke klar og gulaktig. Kontroller om prøven viser tegn på hemolyse og registrere tilstedeværelsen av hemolyse når det er hensiktsmessig. I et klasse II biosikkerhetsskap, overfør serumet til oppsamlingsrør som 250 mikroliter aliquots.Aliquotene må være riktig merket. Frys serumet umiddelbart oppreist i oppbevaringsboksen ved minus 80 grader Celsius, og registrer tidspunktet for prøvelagring. Kontroller at prøvene ble behandlet innen den nødvendige tidsrammen på fire timer.Sentrifuge EDTA-røret ved romtemperatur i 10 minutter ved 1600 ganger g, med maksimal pause påført. Etter sentrifugering vil plasmasupernatanten virke klar og gulaktig. Kontroller om prøven viser tegn på hemolyse og overfør plasmaet til et 15 milliliter sentrifugerør uten å forstyrre det cellulære laget ved hjelp av en engangs serologisk pipette.La et lite restvolum plasma ligge over cellelaget på omtrent fem millimeter. Hvis hemolyse observeres, kast prøven for videre analyse. Sentrifuge plasmaet og et 15 milliliter sentrifugerør for å fjerne eventuelle gjenværende intakte blodceller overført fra det første sentrifugeringstrinnet.Fjern forsiktig røret fra sentrifugen, ikke cellepelleten i bunnen av røret, og overfør en til fire milliliter plasma til en til fire milliliter polypropylen kryogenisk bios eller Eppendorfs ved hjelp av en disponibel serologisk pipette. Et gjenværende volum plasma må være igjen i bunnen av røret for å unngå å forurense plasmaet med blodceller. Frys plasmaet umiddelbart oppreist i oppbevaringsboksen ved minus 80 grader Celsius, og registrer tidspunktet for prøvelagring.Kontroller at prøvene er riktig merket og ble behandlet innen den nødvendige tidsrammen på fire timer. Samle det cellulære laget ved hjelp av en P1000 og filtrert spiss og overfør den til et to milliliter rør. Frys umiddelbart og oppbevar ved minus 80 grader Celsius.Et eksempel på en cfDNA-ekstraksjon av høy kvalitet som kan brukes til nedstrømsapplikasjoner er vist her, mens dette grafiske bildet representerer et eksempel på en uegnet prøve med et høyt nivå av genomisk forurensning. Plasma- eller serumfraksjonen må ha en gul farge. Dette kan variere avhengig av den enkelte prøve.Prøver med hemolyse skal kastes. Vær forsiktig så du ikke fjerner noen cellepellets når du fjerner plasmafraksjonen. Denne protokollen kan også brukes til andre nukleinsyrebaserte og proteinapplikasjoner, for eksempel påvisning av ikke-kodende RNA eller proteiner i serum- og plasmaprøver ved hjelp av immundeteksjonsteknikker.Dette er en veldig standard teknikk som brukes i mange laboratorier. Denne protokollen hjelper forskere med å standardisere hvordan vi utfører analysen vår, da dette er et avgjørende aspekt som er nødvendig for fremtidige kliniske applikasjoner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA basert flytende biopsi: Opplevelsen av Plasma miRNA signatur klassifiserer (MSC) for Lung Cancer Screening

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Karakterisere DNA reparasjon prosesser på forbigående og lang-varer dobbel-strand DNA bryter av Immunofluorescence mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Evaluering av gjennomførbarhet, sikkerhet og nøyaktigheten av en intraoperativ høy intensitet fokusert ultralydapparat for behandling av leveren metastaser

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Langsgående Intravital Imaging av Brain tumor Cell atferd som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulering av sirkulerende tumor celler for nedstrøms molekylær analyse og metastatisk potensiell vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Avbildning av DNA-skade og reparasjon av foci i humane tykktarmskreftceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Automatisert disseksjonsprotokoll for tumorberikelse i vev med lavt tumorinnhold

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...