Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
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Agradecemos à Rede de Pesquisa Biomédica em Câncer (CIBERONC) pelo apoio e pela seguinte concessão do projeto: LB CIBERONC PLATAFORMA: Plataforma CIBERONC para a padronização e promoção da biópsia líquida. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

A aprovação ética prévia foi obtida nos centros participantes antes da extração de amostras de sangue. Os seguintes protocolos de isolamento sérico e plasmá plasma foram realizados de acordo com os princípios éticos para a pesquisa biomédica.
NOTA: Considerações prévias antes de iniciar o protocolo são fornecidas aqui. É necessária aprovação ética prévia para o uso de amostras humanas em pesquisas biomédicas, com o consentimento informado correspondente. Um armário de bi...

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	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. 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Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

A biópsia líquida tem inúmeras aplicações potenciais em diferentes momentos durante o manejo do câncer. Primeiro, no diagnóstico para identificar marcadores moleculares tumorais que sugerem a presença de uma lesão tumoral potencial que poderia ser mais investigada clinicamente. Em segundo lugar, durante o tratamento para monitoramento em tempo real da doença, avaliação da resposta molecular do tratamento, evolução clonal e detecção precoce de recaídas da doença ou resistência ao tratamento. Finalmente,...

O termo "biópsia líquida" foi definido em 20101 como a presença de moléculas (por exemplo, proteína, ácido desoxiribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA)), células ou vesículas extracelulares (por exemplo, exosomos) no sangue e outros fluidos corporais originários do tumor primário. O uso de amostras de biópsia líquida revolucionou a pesquisa de oncologia translacional como biópsias teciduais, limitadas a uma determinada região em um determinado momento, podendo perder clones relevantes devido à heterogeneidade tumoral. Além disso, a biópsia líquida desempenha um papel relevante nos tipos de tumores onde o tecido primário é escasso ou não acessível, pois pode evitar uma biópsia invasiva, reduzindo custos e riscos aos pacientes. Além disso, as características moleculares tumorais estão em constante evolução principalmente devido à pressão terapêutica, e amostras de biópsia líquida podem capturar a dinâmica clonal tumoral, pois podem ser tomadas longitudinalmente, em diferentes momentos clínicos e terapêuticos da doença, como linha de base, no tratamento, na melhor resposta e na progressão da doença ou mesmo antes. O conceito de "biópsia líquida em tempo real" significa que mudanças dinâmicas no tumor podem ser monitoradas em tempo real, permitindo assim a medicina de precisão nesta doença. A biópsia líquida possui inúmeras aplicações potenciais na clínica, incluindo rastreamento e detecção precoce de câncer, monitoramento em tempo real da doença, detecção de doença residual mínima, estudo de mecanismos de resistência ao tratamento e estratificação de pacientes no nível terapêutico1. A detecção precoce da recidiva e progressão da doença são uma necessidade clínica não atendida em muitos tipos de tumores e é um fator-chave para aumentar a sobrevivência e a qualidade de vida dos pacientes com câncer. Modalidades de imagem de rotina e marcadores tumorais solúveis podem não ter a sensibilidade e/ou especificidade necessária para essa tarefa. Assim, novos marcadores preditivos são urgentemente necessários na clínica, como aqueles baseados na circulação de ácidos nucleicos livres.
Os tipos de amostras que são usadas para estudos de biópsia líquida incluem, mas não se limitam a amostras de sangue, urina, saliva e fezes. Outras amostras específicas do tumor podem ser aspirados celulares, fluido cefalorraquidiano, fluido pleural, cisto e ascites fluido, escarro e suco pancreático2. Os líquidos antigos podem conter diferentes tipos de materiais derivados do câncer, células tumorais circulantes (CTC), ou fragmentos como exosóis e DNA tumor circulante livre de células (CTDNA). Os ácidos nucleicos podem ser encapsulados em vesículas extracelulares (EVs) ou liberados em fluidos corporais devido à morte e danos celulares. O DNA livre circulante (CFN) é liberado principalmente na corrente sanguínea a partir de células apoptóticas ou necróticas e está presente em todos os indivíduos, apresentando níveis aumentados em doenças inflamatórias ou oncológicas3. Exosomos são pequenas vesículas extracelulares (~30-150 nm) secretadas por células que contêm ácidos nucleicos, proteínas e lipídios. Essas vesículas fazem parte da rede de comunicação intercelular e são comumente encontradas em muitos tipos de fluidos corporais2. Os ácidos nucleicos fechados dentro dos EVs são protegidos do ambiente áspero dentro dos fluidos corporais, fornecendo assim uma maneira mais robusta de estudar essas moléculas no cenário da biópsia líquida.
No geral, os níveis de ácidos nucleicos circulantes em amostras de biópsia líquida são muito baixos e, portanto, métodos sensíveis são necessários para detecção, como PCR digital ou sequenciamento de última geração (NGS). O manejo pré-analítico da amostra é crucial para prevenir a lise das células sanguíneas e a liberação de DNA intacto, causando contaminação do CFDNA com o DNA genômico. Além disso, deve-se tomar cuidado ao extrair amostras para evitar a presença de inibidores de métodos de análise baseados em enzimas.
Aqui apresentamos um método padronizado para a coleta e armazenamento de amostras de plasma e soro, que é um primeiro passo crucial para aplicações a jusante à base de biópsia líquida, incluindo análises de ácido nucleico circulante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

O termo biópsia líquida (LB) refere-se a moléculas como proteínas, DNA, RNA, células ou vesículas extracelulares no sangue e outros fluidos corporais que se originam do tumor primário e/ou metastático. A LB emergiu como um pilar na pesquisa translacional e começou a fazer parte da prática clínica de oncologia, fornecendo uma alternativa minimamente invasiva à biópsia sólida. A LB permite o monitoramento em tempo real de um tumor através de uma extração de amostra minimamente invasiva, como sangue. As aplicações incluem detecção precoce de câncer, acompanhamento do paciente para detecção de progressão da doença, avaliação de doença residual mínima e identificação potencial de progressão molecular e mecanismo de resistência. Para obter uma análise confiável dessas amostras que possam ser relatadas na clínica, os procedimentos pré-analíticos devem ser cuidadosamente considerados e rigorosamente seguidos. Coleta, qualidade e armazenamento de amostras são etapas cruciais que determinam sua utilidade em aplicações a jusante. Aqui, apresentamos protocolos padronizados do nosso módulo de trabalho de biópsia líquida para coleta, processamento e armazenamento de amostras de plasma e soro para análise de biópsia líquida a jusante com base no DNA livre de circulação. Os protocolos aqui apresentados exigem equipamentos padrão e são suficientemente flexíveis para serem aplicados na maioria dos laboratórios focados em procedimentos biológicos.

Após a centrifugação dos tubos sanguíneos sem anticoagulante, a fase superior parece um amarelo pálido e corresponde à fração do soro (Figura 2). Esta fração é cuidadosamente removida e aliquoted para análise subsequente.
A hemólise pode estar presente na fração plasmática ou sárida, e a fase superior terá uma aparência avermelhada, o que indica a presença e o grau de hemólise (Figura 3).
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A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

A biópsia líquida revolucionou nossa abordagem para estudos translacionais em oncologia, com coleta de amostras, qualidade e armazenamento sendo passos cruciais para sua aplicação clínica bem sucedida. Aqui descrevemos um protocolo padronizado e validado para aplicações de DNA sem circulação a jusante que podem ser aplicados na maioria dos laboratórios de pesquisa translacional.

Um protocolo pré-analítico de biópsia líquida padronizada para aplicações de DNA sem circulação a jusante

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Este é um protocolo padrão para o processamento e armazenamento de amostras de sangue para aplicações de biópsia líquida a jusante com base na circulação de DNA livre. Este é o primeiro protocolo padrão publicado, embora a técnica esteja em uso há vários anos. É fácil de seguir com equipamentos padrão disponíveis na maioria dos laboratórios translacionais ou científicos.O protocolo pode ser realizado por todos os funcionários do laboratório. O protocolo ajuda a padronizar a forma como coletamos e armazenamos amostras, o que, em última análise, impactará na clínica e reduzirá a variabilidade entre diferentes centros realizando a mesma ou similar análise a jusante onde a precisão é de extrema importância. Este método é particularmente útil na pesquisa oncológica e também em aplicações clínicas.No entanto, também pode ser aplicado em outras doenças não cancerígenas onde a biópsia líquida também é usada. Depois que a amostra de sangue foi centrifuada, saber quanto plasma ou soro remover pode ser difícil, mas seguir essas diretrizes específicas ajudará com isso. O resto do protocolo é muito fácil de seguir com pouca experiência em laboratório.Demonstrando o procedimento estará Jorge, um técnico do nosso laboratório. Para começar, centrifufique o tubo contendo sangue fresco à temperatura ambiente por 10 minutos a 1600 vezes g, com a quebra máxima aplicada. Remova cuidadosamente o tubo da centrífuga.A fase superior do supernante sérico parecerá clara e amarelada. Verifique se a amostra apresenta sinais de hemólise e regissou a presença de hemólise quando apropriado. Em um armário de biossegurança classe II, transfira o soro para tubos de coleta como alíquotas de 250 microliter.As alíquotas devem ser corretamente rotuladas. Congele imediatamente o soro vertical na caixa de armazenamento a menos 80 graus Celsius e registe o tempo de armazenamento da amostra. Verifique se as amostras foram processadas dentro do prazo de quatro horas exigido.Centrifugar o tubo EDTA à temperatura ambiente por 10 minutos a 1600 vezes g, com a quebra máxima aplicada. Após a centrifugação, o supernatante de plasma parecerá claro e amarelado. Verifique se a amostra mostra sinais de hemólise e transfira o plasma para um tubo de centrífuga de 15 mililitros sem perturbar a camada celular usando uma pipeta sorológica descartável.Deixe um pequeno volume residual de plasma acima da camada celular a aproximadamente cinco milímetros. Se for observada hemólise, descarte a amostra para análise posterior. Centrifugar o plasma e um tubo de centrífuga de 15 mililitros para remover quaisquer células sanguíneas intactas residuais transportadas da primeira etapa de centrifugação.Remova cuidadosamente o tubo da centrífuga, não a pelota celular na parte inferior do tubo, e transfira de um a quatro mililitros de plasma para um a quatro mililitros de bio criogenia de polipropileno ou Eppendorfs usando uma pipeta sorológica descartável. Um volume residual de plasma deve ser deixado na parte inferior do tubo para evitar contaminar o plasma com células sanguíneas. Congele imediatamente o plasma ereto na caixa de armazenamento a menos 80 graus Celsius, e regise o tempo de armazenamento da amostra.Verifique se as amostras estão corretamente rotuladas e processadas dentro do prazo de quatro horas exigido. Colete a camada celular usando uma ponta P1000 e filtrada e transfira-a para um tubo de dois mililitros. Congele imediatamente e armazene a menos 80 graus Celsius.Um exemplo de extração de CFDNA de alta qualidade que pode ser usada para aplicações a jusante é mostrado aqui, enquanto esta imagem gráfica representa um exemplo de uma amostra inadequada com um alto nível de contaminação genômica. A fração de plasma ou soro deve ser de cor amarela. Isso pode variar dependendo da amostra individual.As amostras com hemólise devem ser descartadas. Tenha cuidado para não remover nenhuma pelota celular ao remover a fração de plasma. Este protocolo também pode ser usado para outras aplicações à base de ácido nucleico e proteínas, como a detecção de RNAs não codificantes ou proteínas em amostras de soro e plasma usando técnicas de detecção de imunoss.Esta é uma técnica muito padrão usada em muitos laboratórios. Este protocolo ajuda os pesquisadores a padronizar a forma como realizamos nossa análise, pois este é um aspecto crucial, necessário para futuras aplicações clínicas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Pesquisa do câncer

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA baseado biópsia líquida: A experiência de miRNA o Plasma assinatura classificador (MSC) para triagem de câncer de pulmão

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Avaliação da viabilidade, segurança e precisão de uma alta intensidade intra-operatória focado dispositivo de ultra-som para o tratamento de metástases hepáticas

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Protocolo automatizado de dissecção para enriquecimento de tumores em tecidos de baixo teor de tumores

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...