Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Сеть биомедицинских исследований в области рака (CIBERONC) за их поддержку и следующий грант проекта: LB CIBERONC PLATFORM: платформа CIBERONC для стандартизации и продвижения жидкой биопсии. ПИ Родриго Толедо, (CIBERONC), 2019-2021.

Предварительное этическое одобрение было получено от участвующих центров перед извлечением образцов крови. Следующие протоколы выделения сыворотки и плазмы были выполнены в соответствии с этическими принципами биомедицинских исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие соо...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

Жидкая биопсия имеет множество потенциальных применений в разное время во время лечения рака. Во-первых, при постановке диагноза идентифицировать молекулярные маркеры опухоли, которые бы предполагали наличие потенциального опухолевого поражения, которое может быть дополнительно ис?...

Термин «жидкая биопсия» был определен в 2010году1 как присутствие молекул (например, белка, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК)), клеток или внеклеточных везикул (например, экзосом) в крови и других жидкостях организма, которые происходят из первичной опухоли. Использование образцов жидкой биопсии произвело революцию в трансляционных онкологических исследованиях, поскольку биопсия тканей, ограниченная определенной областью в определенный момент, может пропустить соответствующие клоны из-за гетерогенности опухоли. Кроме того, жидкая биопсия играет важную роль в типах опухолей, где первичная ткань скудна или недоступна, поскольку она может избежать инвазивной биопсии, снижая затраты и риск для пациентов. Кроме того, молекулярные характеристики опухоли постоянно развиваются в основном из-за терапевтического давления, и образцы жидкой биопсии могут захватывать клональную динамику опухоли, поскольку их можно брать продольно, в различные клинические и терапевтические периоды заболевания, такие как исходный уровень, лечение, наилучший ответ и прогрессирование заболевания или даже раньше. Концепция «жидкой биопсии в реальном времени» означает, что динамические изменения в опухоли могут контролироваться в режиме реального времени, что позволяет проводить прецизионную медицину при этом заболевании. Жидкая биопсия имеет множество потенциальных применений в клинике, включая скрининг и раннее выявление рака, мониторинг заболевания в режиме реального времени, выявление минимального остаточного заболевания, изучение механизмов резистентности к лечению и стратификацию пациентов на терапевтическом уровне1. Раннее выявление рецидива и прогрессирования заболевания является неудовлетворенной клинической потребностью во многих типах опухолей и является ключевым фактором повышения выживаемости и качества жизни больных раком. Обычные методы визуализации и растворимые опухолевые маркеры могут не иметь чувствительности и / или специфичности, необходимых для этой задачи. Таким образом, в клинике срочно необходимы новые прогностические маркеры, такие как те, которые основаны на циркулирующих свободных нуклеиновых кислотах.
Типы образцов, которые используются для исследований жидкой биопсии, включают, но не ограничиваются ими, образцы крови, мочи, слюны и стула. Другими опухолеспецифическими образцами могут быть клеточные аспираты, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, киста и асцит жидкости, мокрота и панкреатический сок2. Первые жидкости могут содержать различные типы материалов, полученных из рака, циркулирующие опухолевые клетки (CTC) или фрагменты, такие как экзосомы и бесклеточная циркулирующая опухолевая ДНК (ctDNA). Нуклеиновые кислоты могут быть инкапсулированы во внеклеточные везикулы (EV) или высвобождаться в жидкости организма из-за гибели и повреждения клеток. Циркулирующая свободная ДНК (cfDNA) в основном высвобождается в кровоток из апоптотических или некротических клеток и присутствует у всех людей, показывая повышенные уровни при воспалительных или онкологических заболеваниях3. Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы (~30-150 нм), секретируемые клетками, содержащими нуклеиновые кислоты, белки и липиды. Эти везикулы являются частью межклеточной коммуникационной сети и обычно встречаются во многих типах жидкостей организма2. Нуклеиновые кислоты, заключенные внутри электромобилей, защищены от суровой среды в жидкостях организма, что обеспечивает более надежный способ изучения этих молекул в условиях жидкой биопсии.
В целом, уровни циркулирующих нуклеиновых кислот в жидких образцах биопсии очень низкие, и поэтому для обнаружения необходимы чувствительные методы, такие как цифровая ПЦР или секвенирование следующего поколения (NGS). Преаналитическое управление образцом имеет решающее значение для предотвращения лизиса клеток крови и высвобождения интактной ДНК, вызывая загрязнение cfDNA геномной ДНК. Кроме того, при извлечении образцов необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать присутствия ингибиторов ферментных методов анализа.
Здесь мы представляем стандартизированный метод сбора и хранения образцов плазмы и сыворотки, который является важным первым шагом для последующих применений на основе жидкой биопсии, включая анализ циркулирующих нуклеиновых кислот.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

Термин жидкая биопсия (LB) относится к молекулам, таким как белки, ДНК, РНК, клетки или внеклеточные везикулы в крови и других жидкостях организма, которые происходят из первичной и / или метастатической опухоли. LB стал опорой в трансляционных исследованиях и начал становиться частью клинической онкологической практики, обеспечивая минимально инвазивную альтернативу твердой биопсии. LB позволяет контролировать опухоль в режиме реального времени с помощью минимально инвазивной экстракции образца, такого как кровь. Приложения включают раннее выявление рака, наблюдение за пациентами для выявления прогрессирования заболевания, оценку минимального остаточного заболевания и потенциальную идентификацию молекулярной прогрессии и механизма резистентности. Для того чтобы добиться достоверного анализа этих образцов, о которых можно сообщить в клинику, преаналитические процедуры следует тщательно обдумывать и строго соблюдать. Сбор, качество и хранение образцов являются важнейшими шагами, определяющими их полезность в последующих приложениях. Здесь мы представляем стандартизированные протоколы из нашего рабочего модуля жидкой биопсии для сбора, обработки и хранения образцов плазмы и сыворотки для последующего анализа жидкой биопсии на основе свободной от циркуляции ДНК. Представленные здесь протоколы требуют стандартного оборудования и достаточно гибки для применения в большинстве лабораторий, ориентированных на биологические процедуры.

После центрифугирования пробирок крови без антикоагулянта верхняя фаза выглядит бледно-желтой и соответствует сывороточной фракции (рисунок 2). Эта фракция тщательно удаляется и аликвотируется для последующего анализа.
Гемолиз может присутствовать как...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

Жидкая биопсия произвела революцию в нашем подходе к трансляционным исследованиям онкологии, при этом сбор, качество и хранение образцов являются важнейшими шагами для ее успешного клинического применения. Здесь мы описываем стандартизированный и проверенный протокол для последующих приложений ДНК без циркуляции, который может быть применен в большинстве трансляционных исследовательских лабораторий.

Стандартизированный преаналитический протокол жидкой биопсии для последующих применений ДНК без циркуляции

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Это стандартный протокол для обработки и хранения образцов крови для последующей жидкой биопсии на основе циркулирующей свободной ДНК. Это первый опубликованный стандартный протокол, хотя техника используется уже несколько лет. За ним легко следить со стандартным оборудованием, доступным в большинстве трансляционных или научных лабораторий.Протокол может быть выполнен всем персоналом лаборатории. Протокол помогает стандартизировать то, как мы собираем и храним образцы, что в конечном итоге повлияет на клинику и уменьшит изменчивость между различными центрами, выполняющими один и тот же или аналогичный последующий анализ, где точность имеет первостепенное значение. Этот метод особенно полезен в онкологических исследованиях, а также в клинических применениях.Тем не менее, он также может применяться при других нераковых заболеваниях, где также используется жидкая биопсия. После того, как образец крови был центрифугирован, знание того, сколько плазмы или сыворотки удалить, может быть затруднено, но следование этим конкретным рекомендациям поможет в этом. Остальная часть протокола очень проста в соблюдении с ограниченным опытом работы в лаборатории.Демонстрировать процедуру будет Хорхе, техник из нашей лаборатории. Для начала центрифугируют пробирку, содержащую свежую кровь комнатной температуры, в течение 10 минут в 1600 раз г, с максимальным перерывом. Осторожно извлеките трубку из центрифуги.Верхняя фаза сывороточного супернатанта будет казаться прозрачной и желтоватой. Проверьте, показывает ли образец признаки гемолиза и запишите наличие гемолиза, когда это необходимо. В шкафу биобезопасности класса II перенесите сыворотку в сборные пробирки в виде 250-микролитровой аликвоты.Аликвоты должны быть правильно обозначены. Немедленно заморозьте сыворотку в вертикальном положении в ящике для хранения при минус 80 градусах Цельсия и запишите время хранения образца. Убедитесь, что образцы были обработаны в течение требуемых четырех часов.Центрифугировать эдта-трубку при комнатной температуре в течение 10 минут при 1600 г, с максимальным перерывом. После центрифугирования супернатант плазмы будет казаться прозрачным и желтоватым. Проверьте, есть ли в образце признаки гемолиза, и перенесите плазму в 15-миллилитровую центрифужную трубку, не нарушая клеточный слой, используя одноразовую серологическую пипетку.Оставьте небольшой остаточный объем плазмы над клеточным слоем примерно в пять миллиметров. Если наблюдается гемолиз, выбросьте образец для дальнейшего анализа. Центрифугирование плазмы и 15-миллилитровой центрифужной трубки для удаления любых остаточных неповрежденных клеток крови, перенесенных с первой стадии центрифугирования.Осторожно извлеките трубку из центрифуги, а не гранулу ячейки в нижней части трубки, и переведите от одного до четырех миллилитров плазмы в один-четыре миллилитра полипропиленовой криогенной биос или Eppendorfs с помощью одноразовой серологической пипетки. Остаточный объем плазмы должен быть оставлен в нижней части трубки, чтобы избежать загрязнения плазмы клетками крови. Немедленно заморозьте плазму в вертикальном положении в ящике для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия и запишите время хранения образца.Убедитесь, что образцы правильно маркированы и обработаны в течение требуемых четырех часов. Соберите клеточный слой с помощью P1000 и отфильтрованного наконечника и переложите его в двухмиллилитровую трубку. Немедленно заморозить и хранить при минус 80 градусах Цельсия.Здесь показан пример высококачественной экстракции cfDNA, которая может быть использована для последующих применений, тогда как это графическое изображение представляет собой пример неподходящего образца с высоким уровнем геномного загрязнения. Плазменная или сывороточная фракция должна быть желтого цвета. Это может варьироваться в зависимости от конкретного образца.Образцы с гемолизом следует выбросить. Будьте осторожны, чтобы не удалить гранулы клеток при удалении плазменной фракции. Этот протокол также может быть использован для других применений на основе нуклеиновых кислот и белков, таких как обнаружение некодирующих РНК или белков в образцах сыворотки и плазмы с использованием методов иммунообнаружения.Это очень стандартная методика, используемая во многих лабораториях. Этот протокол помогает исследователям стандартизировать то, как мы выполняем наш анализ, поскольку это важный аспект, необходимый для будущих клинических применений.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

МикроРНК основе жидкого биопсия: Опыт плазмы Мирна подпись классификатора (MSC) для скрининга рака легких

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Целевые ячейки предварительного обогащения и весь геном усилители на одну ячейку вниз по течению характеристика

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Характеризуя процессов репарации ДНК в переходных и Long-lasting двухнитевые разрывы ДНК по микроскопии иммунофлуоресценции

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Оценки целесообразности, безопасность и точность интраоперационной высокой интенсивности сосредоточены ультразвуковое устройство для лечения метастазов в печени

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Продольная интравитальная визуализация поведения опухолевых клеток головного мозга в ответ на инвазивную хирургическую биопсию

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Микроманипуляции циркулирующей опухолевой клетки для молекулярного анализа вниз по течению и метастатического потенциального оценивания

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Иммунофлуоресценция Визуализация повреждения ДНК и ремонт Фочи в раковых клетках толстой кишки человека

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Автоматизированный протокол рассечения для обогащения опухоли в тканях с низким содержанием опухоли

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...