Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
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Queremos agradecer a la Red de Investigación Biomédica en Cáncer (CIBERONC) su apoyo y la siguiente subvención del proyecto: LB PLATAFORMA CIBERONC: Plataforma CIBERONC para la estandarización y promoción de la biopsia líquida. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Se obtuvo la aprobación ética previa de los centros participantes antes de la extracción de muestras de sangre. Los siguientes protocolos para el aislamiento de suero y plasma se realizaron de acuerdo con los principios éticos para la investigación biomédica.
NOTA: Aquí se proporcionan consideraciones previas antes de comenzar el protocolo. Se requiere la aprobación ética previa para el uso de muestras humanas en investigación biomédica, con el correspondiente consentimiento informa...

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	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. 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Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en diferentes momentos durante el tratamiento del cáncer. Primero, en el momento del diagnóstico para identificar marcadores moleculares tumorales que sugieran la presencia de una posible lesión tumoral que podría investigarse más a fondo clínicamente. En segundo lugar, durante el tratamiento para la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la evaluación de la respuesta molecular del tratamiento, la evolución clonal y la detección precoz de rec...

El término "biopsia líquida" se definió en 20101 como la presencia de moléculas (por ejemplo, proteína, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN)), células o vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas) en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario. El uso de muestras de biopsia líquida ha revolucionado la investigación oncológica traslacional, ya que las biopsias de tejido, limitadas a una región particular en un momento determinado, pueden perder clones relevantes debido a la heterogeneidad tumoral. Además, la biopsia líquida juega un papel relevante en los tipos de tumores donde el tejido primario es escaso o no accesible, ya que puede evitar una biopsia invasiva, reduciendo los costos y el riesgo para los pacientes. Además, las características moleculares del tumor están en constante evolución debido principalmente a la presión de la terapia, y las muestras de biopsia líquida pueden capturar la dinámica clonal del tumor, ya que se pueden tomar longitudinalmente, en diferentes momentos clínicos y terapéuticos de la enfermedad, como la línea de base, en el tratamiento, la mejor respuesta y en la progresión de la enfermedad o incluso antes. El concepto de "biopsia líquida en tiempo real" significa que los cambios dinámicos en el tumor se pueden monitorear en tiempo real, lo que permite la medicina de precisión en esta enfermedad. La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en la clínica, incluyendo el cribado y la detección precoz del cáncer, la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la detección de la enfermedad residual mínima, el estudio de los mecanismos de resistencia al tratamiento y la estratificación de los pacientes a nivel terapéutico1. La detección precoz de la recurrencia y progresión de la enfermedad es una necesidad clínica insatisfecha en muchos tipos de tumores y es un factor clave para aumentar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cáncer. Las modalidades de diagnóstico por imágenes de rutina y los marcadores tumorales solubles pueden carecer de la sensibilidad y/o especificidad requerida para esta tarea. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos marcadores predictivos en la clínica, como los basados en ácidos nucleicos libres circulantes.
Los tipos de muestras que se utilizan para los estudios de biopsia líquida incluyen, entre otros, muestras de sangre, orina, saliva y heces. Otras muestras específicas del tumor pueden ser aspirados celulares, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido de quistes y ascitis, esputo y jugo pancreático2. Los primeros líquidos pueden contener diferentes tipos de materiales derivados del cáncer, células tumorales circulantes (CTC) o fragmentos como exosomas y ADN tumoral circulante libre de células (ctDNA). Los ácidos nucleicos pueden encapsularse en vesículas extracelulares (EV) o liberarse en los fluidos corporales debido a la muerte y el daño celular. El ADN libre circulante (cfDNA) se libera principalmente en el torrente sanguíneo desde células apoptóticas o necróticas y está presente en todos los individuos, mostrando niveles aumentados en enfermedades inflamatorias u oncológicas3. Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares (~30-150 nm) secretadas por células que contienen ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Estas vesículas forman parte de la red de comunicación intercelular y se encuentran comúnmente en muchos tipos de fluidos corporales2. Los ácidos nucleicos encerrados dentro de los EV están protegidos del ambiente hostil dentro de los fluidos corporales, proporcionando así una forma más robusta de estudiar estas moléculas en el entorno de biopsia líquida.
En general, los niveles de ácidos nucleicos circulantes en las muestras de biopsia líquida son muy bajos y, por lo tanto, se necesitan métodos sensibles para la detección, como la PCR digital o la secuenciación de próxima generación (NGS). El manejo preanalítico de la muestra es crucial para prevenir la lisis de las células sanguíneas y la liberación de ADN intacto, causando la contaminación del cfDNA con el ADN genómico. Además, se debe tener cuidado al extraer muestras para evitar la presencia de inhibidores de los métodos de análisis basados en enzimas.
Aquí presentamos un método estandarizado para la recolección y almacenamiento de muestras de plasma y suero, que es un primer paso crucial para las aplicaciones posteriores basadas en biopsia líquida, incluidos los análisis de ácidos nucleicos circulantes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

El término biopsia líquida (LB) se refiere a moléculas como proteínas, ADN, ARN, células o vesículas extracelulares en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario y / o metastásico. LB se ha convertido en un pilar en la investigación traslacional y ha comenzado a formar parte de la práctica de oncología clínica, proporcionando una alternativa mínimamente invasiva a la biopsia sólida. El LB permite el monitoreo en tiempo real de un tumor a través de una extracción de muestra mínimamente invasiva, como la sangre. Las aplicaciones incluyen la detección temprana del cáncer, el seguimiento del paciente para la detección de la progresión de la enfermedad, la evaluación de la enfermedad residual mínima y la identificación potencial de la progresión molecular y el mecanismo de resistencia. Para lograr un análisis confiable de estas muestras que se puede informar en la clínica, los procedimientos preanalíticos deben considerarse cuidadosamente y seguirse estrictamente. La recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento son pasos cruciales que determinan su utilidad en aplicaciones posteriores. Aquí, presentamos protocolos estandarizados de nuestro módulo de trabajo de biopsia líquida para recolectar, procesar y almacenar muestras de plasma y suero para el análisis de biopsia líquida aguas abajo basado en ADN libre de circulación. Los protocolos presentados aquí requieren equipos estándar y son lo suficientemente flexibles para ser aplicados en la mayoría de los laboratorios centrados en procedimientos biológicos.

Después de la centrifugación de los tubos sanguíneos sin anticoagulante, la fase superior aparece de un amarillo pálido y corresponde a la fracción sérica (Figura 2). Esta fracción se retira cuidadosamente y se alicita para su posterior análisis.
La hemólisis puede estar presente en la fracción plasmática o sérica, y la fase superior tendrá un aspecto rojizo, lo que indica la presencia y el grado de hemólisis (Figura 3)....

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A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

La biopsia líquida ha revolucionado nuestro enfoque de los estudios traslacionales oncológicos, siendo la recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento pasos cruciales para su aplicación clínica exitosa. Aquí describimos un protocolo estandarizado y validado para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo que se puede aplicar en la mayoría de los laboratorios de investigación traslacional.

Un protocolo preanalítico estandarizado de biopsia líquida para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Este es un protocolo estándar para el procesamiento y almacenamiento de muestras de sangre para aplicaciones de biopsia líquida aguas abajo basadas en ADN libre circulante. Este es el primer protocolo estándar publicado, aunque la técnica ha estado en uso durante varios años. Es fácil de seguir con el equipo estándar disponible en la mayoría de los laboratorios traslacionales o científicos.El protocolo puede ser realizado por todo el personal del laboratorio. El protocolo ayuda a estandarizar la forma en que recolectamos y almacenamos muestras, lo que en última instancia tendrá un impacto en la clínica y reducirá la variabilidad entre los diferentes centros que realizan el mismo o similar análisis posterior donde la precisión es de suma importancia. Este método es particularmente útil en la investigación oncológica y también en aplicaciones clínicas.Sin embargo, también se puede aplicar en otras enfermedades no cancerosas donde también se usa la biopsia líquida. Después de que la muestra de sangre se haya centrifugado, saber cuánto plasma o suero eliminar puede ser difícil, pero seguir estas pautas específicas ayudará con esto. El resto del protocolo es muy fácil de seguir con experiencia limitada en el laboratorio.Demostrando el procedimiento estará Jorge, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar, centrifugar el tubo que contiene sangre fresca a temperatura ambiente durante 10 minutos a 1600 veces g, con la ruptura máxima aplicada. Retire con cuidado el tubo de la centrífuga.La fase superior del sobrenadante sérico aparecerá clara y amarillenta. Compruebe si la muestra muestra signos de hemólisis y registre la presencia de hemólisis cuando corresponda. En un gabinete de bioseguridad de Clase II, transfiera el suero a tubos de recolección como alícuotas de 250 microlitros.Las alícuotas deben estar correctamente etiquetadas. Congele inmediatamente el suero en posición vertical en la caja de almacenamiento a menos 80 grados centígrados y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra. Verifique que las muestras se procesaron dentro del plazo requerido de cuatro horas.Centrifugar el tubo EDTA a temperatura ambiente durante 10 minutos a 1600 veces g, con la rotura máxima aplicada. Después de la centrifugación, el sobrenadante plasmático aparecerá claro y amarillento. Compruebe si la muestra muestra signos de hemólisis y transfiera el plasma a un tubo de centrífuga de 15 mililitros sin alterar la capa celular utilizando una pipeta serológica desechable.Deje un pequeño volumen residual de plasma por encima de la capa celular a aproximadamente cinco milímetros. Si se observa hemólisis, deseche la muestra para su posterior análisis. Centrifugar el plasma y un tubo de centrífuga de 15 mililitros para eliminar cualquier célula sanguínea intacta residual arrastrada desde el primer paso de centrifugación.Retire con cuidado el tubo de la centrífuga, no el pellet celular en el fondo del tubo, y transfiera de uno a cuatro mililitros de plasma a uno a cuatro mililitros de bios criogénicos de polipropileno o Eppendorfs usando una pipeta serológica desechable. Se debe dejar un volumen residual de plasma en la parte inferior del tubo para evitar contaminar el plasma con células sanguíneas. Congele inmediatamente el plasma en posición vertical en la caja de almacenamiento a menos 80 grados centígrados y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra.Verifique que las muestras estén correctamente etiquetadas y se procesaron dentro del plazo requerido de cuatro horas. Recoja la capa celular usando un P1000 y una punta filtrada y transfiérala a un tubo de dos mililitros. Congele inmediatamente y almacene a menos 80 grados centígrados.Aquí se muestra un ejemplo de una extracción de cfDNA de alta calidad que se puede utilizar para aplicaciones posteriores, mientras que esta imagen gráfica representa un ejemplo de una muestra inadecuada con un alto nivel de contaminación genómica. La fracción plasmática o sérica debe ser de color amarillo. Esto puede variar dependiendo de la muestra individual.Las muestras con hemólisis deben descartarse. Tenga cuidado de no eliminar ningún pellet celular al extraer la fracción plasmática. Este protocolo también se puede utilizar para otras aplicaciones basadas en ácidos nucleicos y proteínas, como la detección de ARN o proteínas no codificantes en muestras de suero y plasma utilizando técnicas de inmunodetección.Esta es una técnica muy estándar utilizada en muchos laboratorios. Este protocolo ayuda a los investigadores a estandarizar cómo realizamos nuestros análisis, ya que este es un aspecto crucial, necesario para futuras aplicaciones clínicas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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