Name: a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

Vi vill tacka Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) för deras stöd och följande projektbidrag: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC plattform för standardisering och främjande av flytande biopsi. Pi Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Tidigare etiskt godkännande erhölls från deltagande centra före utvinning av blodprover. Följande protokoll för serum- och plasmaisolering utfördes i enlighet med de etiska principerna för biomedicinsk forskning.
OBS: Tidigare överväganden innan protokollet påbörjas finns här. Förhandsetiskt godkännande krävs för användning av humanprover i biomedicinsk forskning, med motsvarande informerade samtycke. Ett klass II biosäkerhetsskåp krävs för att hantera blodprover. En labb...

<ol>
	<li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy.">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis.">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li><li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer.">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).</li><li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis,+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer.">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li><li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time.">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).</li><li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges.">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li><li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin,+immunoglobulin+G,+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR.">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li><li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sampling+to+sequencing:+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube.">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002 (2021).</li><li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance.">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li><li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA:+A+systematic+review+of+the+methodology+literature.">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).</li><li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma.">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li><li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA.">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).</li><li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer.">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).</li><li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping.">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li><li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease.">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li><li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival.">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612 (2021).</li><li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+(pre)analytical+work+flows.">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li><li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases.">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li><li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer.">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).</li></ol>

Den flytande biopsin har många potentiella tillämpningar vid olika tidpunkter under hanteringen av cancer. Först vid diagnos för att identifiera tumörmolekylära markörer som skulle föreslå förekomsten av en potentiell tumörskada som kan undersökas ytterligare kliniskt. För det andra, under behandling för realtidsövervakning av sjukdomen, bedömning av behandlingsmolekylärt svar, klonal evolution och tidig upptäckt av sjukdomsåterfall eller behandlingsresistens. Slutligen, efter den kirurgiska behandling...

Termen "flytande biopsi" definierades 20101 som närvaron av molekyler (t.ex. protein, deoxiribonukleinsyra (DNA), ribonukleinsyra (RNA)), celler eller extracellulära vesiklar (t.exosomer) i blod och andra kroppsvätskor som härrör från den primära tumören. Användningen av flytande biopsiprover har revolutionerat translationell onkologiforskning eftersom vävnadsbiopsier, begränsade till en viss region vid ett visst ögonblick, kan missa relevanta kloner på grund av tumörheterogenitet. Dessutom spelar flytande biopsi en relevant roll i tumörtyper där primär vävnad är knapp eller inte tillgänglig, eftersom det kan undvika en invasiv biopsi, vilket minskar kostnaderna och risken för patienterna. Dessutom utvecklas tumörmolekylära egenskaper ständigt främst på grund av terapitrycket, och flytande biopsiprover kan fånga tumörklonaldynamiken eftersom de kan tas i längdriktningen, i olika kliniska och terapeutiska tider av sjukdomen, såsom baslinje, vid behandling, bästa svar och vid sjukdomsprogression eller till och med tidigare. Begreppet "flytande biopsi i realtid" innebär att dynamiska förändringar i tumören kan övervakas i realtid, vilket möjliggör precisionsmedicin vid denna sjukdom. Den flytande biopsin har många potentiella tillämpningar i kliniken, inklusive screening och tidig upptäckt av cancer, realtidsövervakning av sjukdom, upptäckt av minimal restsjukdom, studier av mekanismer för behandlingsresistens och stratifiering av patienter på terapeutisk nivå1. Tidig upptäckt av återkommande och progression av sjukdomar är ett ouppfyllt kliniskt behov i många tumörtyper och är en nyckelfaktor för att öka överlevnaden och livskvaliteten för cancerpatienter. Rutinmässiga avbildningsmetoder och lösliga tumörmarkörer kan sakna den känslighet och / eller specificitet som krävs för denna uppgift. Således behövs nya prediktiva markörer i kliniken, såsom de som är baserade på cirkulerande fria nukleinsyror.
De typer av prover som används för flytande biopsistudier inkluderar men är inte begränsade till blod-, urin-, saliv- och avföringsprover. Andra tumörspecifika prover kan vara cellsaspirater, cerebrospinalvätska, pleuravätska, cyst- och ascitesvätska, sputum och bukspottkörteljuice2. De tidigare vätskorna kan innehålla olika typer av cancer-härledda material, cirkulerande tumörceller (CTC) eller fragment såsom exosomer och cellfritt cirkulerande tumör-DNA (ctDNA). Nukleinsyror kan vara inkapslade i extracellulära vesiklar (EV) eller släppas ut i kroppsvätskor på grund av celldöd och skada. Cirkulerande fritt DNA (CFDNA) frigörs huvudsakligen i blodomloppet från apoptotiska eller nekrotiska celler och finns hos alla individer, vilket visar ökade nivåer vid inflammatoriska eller onkologiska sjukdomar3. Exosomer är små extracellulära vesiklar (~ 30-150 nm) utsöndras av celler som innehåller nukleinsyror, proteiner och lipider. Dessa vesiklar utgör en del av det intercellulära kommunikationsnätverket och finns vanligtvis i många typer av kroppsvätskor2. Nukleinsyrorna som är inneslutna i elbilar är skyddade från den hårda miljön i kroppsvätskor, vilket ger ett mer robust sätt att studera dessa molekyler i flytande biopsiinställning.
Sammantaget är nivåerna av cirkulerande nukleinsyror i flytande biopsiprover mycket låga, och därför behövs känsliga metoder för detektion, såsom digital PCR eller nästa generations sekvensering (NGS). Preanalytisk hantering av provet är avgörande för att förhindra blodcellslys och frisättning av intakt DNA, vilket orsakar kontaminering av CFDNA med det genomiska DNA. Dessutom måste man vara försiktig vid extraktion av prover för att undvika förekomst av hämmare av enzymbaserade analysmetoder.
Här presenterar vi en standardiserad metod för insamling och lagring av plasma- och serumprover, vilket är ett avgörande första steg för flytande biopsibaserade nedströmsapplikationer, inklusive cirkulerande nukleinsyraanalyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010010</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367525</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT411150</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368965</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430662</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL Vacutainer K2 EDTA tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367864</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991BA</td>
			<td>Several quantification methods are available with a&#160; specific application for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological disposable pipettes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366468</td>
			<td>Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST 16 &#160;10688725</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer storage boxes for 1&#8211;4 mLcryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431120</td>
			<td>These boxes are needed when using 4 mL vials for storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette tips</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>4809</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streck&#160;Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL</td>
			<td>Streck</td>
			<td>218997</td>
			<td>These tubes can be used for plasma collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>2180104</td>
			<td>Any standard tubes/equipment can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized liquid biopsy preanalytical protocol for downstream circulating-free dna applications

Termen flytande biopsi (LB) avser molekyler som proteiner, DNA, RNA, celler eller extracellulära vesiklar i blod och andra kroppsvätskor som härrör från den primära och / eller metastatiska tumören. LB har framstått som en grundpelare i translationell forskning och har börjat bli en del av klinisk onkologipraxis, vilket ger ett minimalt invasivt alternativ till fast biopsi. LB möjliggör realtidsövervakning av en tumör via en minimalt invasiv provutvinning, såsom blod. Applikationerna inkluderar tidig upptäckt av cancer, patientuppföljning för upptäckt av sjukdomsprogression, bedömning av minimal restsjukdom och potentiell identifiering av molekylär progression och resistensmekanism. För att uppnå en tillförlitlig analys av dessa prover som kan rapporteras i kliniken bör de preanalytiska procedurerna noggrant övervägas och följas strikt. Provinsamling, kvalitet och lagring är viktiga steg som avgör deras användbarhet i underordnade program. Här presenterar vi standardiserade protokoll från vår flytande biopsiarbetsmodul för insamling, bearbetning och lagring av plasma- och serumprover för nedströms flytande biopsianalys baserat på cirkulerande fritt DNA. Protokollen som presenteras här kräver standardutrustning och är tillräckligt flexibla för att kunna tillämpas i de flesta laboratorier som fokuserar på biologiska förfaranden.

Efter centrifugering av blodrören utan antikoagulant uppträder den övre fasen en blekgul och motsvarar serumfraktionen (figur 2). Denna fraktion avlägsnas försiktigt och alikvoteras för efterföljande analys.
Hemolys kan vara närvarande i antingen plasma- eller serumfraktionen, och den övre fasen kommer att ha ett rödaktigt utseende, vilket indikerar närvaron och graden av hemolys (Figur 3).
Efter...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications at JoVE.com

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

Den flytande biopsin har revolutionerat vårt tillvägagångssätt för onkologiska translationella studier, med provinsamling, kvalitet och lagring som avgörande steg för dess framgångsrika kliniska tillämpning. Här beskriver vi ett standardiserat och validerat protokoll för nedströms cirkulationsfria DNA-applikationer som kan tillämpas i de flesta translationella forskningslaboratorier.

Ett standardiserat preanalytiskt protokoll för flytande biopsi för nedströms cirkulationsfria DNA-applikationer

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Detta är ett standardprotokoll för bearbetning och lagring av blodprover för nedströms flytande biopsiapplikationer baserade på cirkulerande fritt DNA. Detta är det första standardprotokollet som publicerats, även om tekniken har använts i flera år. Det är lätt att följa med standardutrustning som finns i de flesta translationella eller vetenskapliga laboratorier.Protokollet kan utföras av all laboratoriepersonal. Protokollet hjälper till att standardisera hur vi samlar in och lagrar prover, vilket i slutändan kommer att påverka kliniken och minska variationen mellan olika centra som utför samma eller liknande nedströmsanalys där precision är av yttersta vikt. Denna metod är särskilt användbar inom onkologiforskning och även i kliniska tillämpningar.Det kan dock också tillämpas i andra icke-cancersjukdomar där den flytande biopsin också används. Efter att blodprovet har centrifugerats kan det vara svårt att veta hur mycket plasma eller serum som ska tas bort, men att följa dessa specifika riktlinjer hjälper till med detta. Resten av protokollet är mycket lätt att följa med begränsad erfarenhet i laboratoriet.Demonstrerar proceduren kommer att vara Jorge, en tekniker från vårt laboratorium. För att börja, centrifugera röret som innehåller färskt blod vid rumstemperatur i 10 minuter vid 1600 gånger g, med maximal paus applicerad. Ta försiktigt bort röret från centrifugen.Den övre fasen av serumsupernatanten kommer att se klar och gulaktig ut. Kontrollera om provet visar tecken på hemolys och registrera närvaron av hemolys när det är lämpligt. I ett klass II-biosäkerhetsskåp, överför serumet till uppsamlingsrör som 250-mikroliter alikvoter.Alikvoterna måste vara korrekt märkta. Frys omedelbart serumet upprätt i förvaringslådan vid minus 80 grader Celsius och registrera tiden för provlagring. Kontrollera att proverna har bearbetats inom den tidsram på fyra timmar som krävs.Centrifugera EDTA-röret vid rumstemperatur i 10 minuter vid 1600 gånger g, med maximal paus. Efter centrifugering kommer plasmasupernatanten att se klar och gulaktig ut. Kontrollera om provet visar tecken på hemolys och överför plasman till ett 15-ml centrifugrör utan att störa cellskiktet med en serologisk engångspipett.Lämna en liten restvolym plasma ovanför cellskiktet vid cirka fem millimeter. Om hemolys observeras, kassera provet för vidare analys. Centrifugera plasman och ett 15-milliliters centrifugrör för att avlägsna eventuella kvarvarande intakta blodkroppar som överförs från det första centrifugeringssteget.Ta försiktigt bort röret från centrifugen, inte cellpelleten i botten av röret, och överför en till fyra milliliter plasma till en till fyra milliliter polypropen kryogena bios eller Eppendorfs med en serologisk engångspipett. En återstående volym plasma måste lämnas i botten av röret för att undvika att förorena plasman med blodkroppar. Frys omedelbart plasman upprätt i förvaringslådan vid minus 80 grader Celsius och registrera tiden för provlagring.Kontrollera att proverna är korrekt märkta och har bearbetats inom den tidsram på fyra timmar som krävs. Samla cellskiktet med en P1000 och filtrerad spets och överför den till ett två-milliliter rör. Frys omedelbart och förvara vid minus 80 grader Celsius.Ett exempel på en högkvalitativ CFDNA-extraktion som kan användas för nedströmsapplikationer visas här, medan denna grafiska bild representerar ett exempel på ett olämpligt prov med en hög nivå av genomisk kontaminering. Plasma- eller serumfraktionen måste vara en gul färg. Detta kan variera beroende på det enskilda provet.Prover med hemolys ska kasseras. Var försiktig så att du inte tar bort någon cellpellet när du tar bort plasmafraktionen. Detta protokoll kan också användas för andra nukleinsyrabaserade och proteinapplikationer, såsom detektion av icke-kodande RNA eller proteiner i serum- och plasmaprover med hjälp av immundetekteringstekniker.Detta är en mycket standardteknik som används i många laboratorier. Detta protokoll hjälper forskare att standardisera hur vi utför vår analys eftersom detta är en avgörande aspekt som är nödvändig för framtida kliniska tillämpningar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MikroRNA baserat Liquid Biopsy: Upplevelsen av den Plasma miRNA signatur klassificerare (MSC) för Lung Cancer Screening

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytta uppåt: Ett enkelt och flexibelt In Vitro tredimensionella Invasion Assay protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Karaktärisera DNA reparationsprocesser vid övergående och långvarig dubbel-strand DNA raster med hjälp av immunofluorescens mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Utvärdering av genomförbarhet, säkerhet och noggrannhet av en intraoperativ högintensiva fokuserat ultraljud enhet för behandling av levermetastaser

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinell Intravital avbildning av hjärntumör cell beteende som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation av cirkulerande tumör celler för nedströms molekylär analys och metastatisk potentiell bedömning

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens imaging av DNA-skador och reparation foci i mänskliga kolon cancerceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Automatiserat dissektionsprotokoll för tumöranrikning i vävnader med lågt tumörinnehåll

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...