Name: drug treatment by central venous catheter in a mouse model of angiotensin ii induced abdominal aortic aneurysm and monitoring by 3d ultrasound
Uploaded: 2022-08-04T13:50:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a los equipos del Prof. Podesser y del Prof. Ellmeier (Departamento de Investigación Biomédica e Instalación Central para la Cría y Cría de Animales de Laboratorio, Universidad Médica de Viena) por su asistencia en los experimentos con animales. La tinción tricrómica AAA fue realizada amablemente por Monika Weiss y el Prof. Peter Petzelbauer (Departamento de Dermatología, Universidad Médica de Viena). Este trabajo fue apoyado por el Austrian Science Fund [SFB project F 5409-B21]. Marc Bailey cuenta con el apoyo personal de la British Heart Foundation [FS/18/12/33270].

<ol>
	<li>Busch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysm+to+the+translational+needs+of+vascular+surgery.">Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery.</a> JVS-Vascular Science. 2, 219-234 (2021).</li><li>Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+abdominal+aortic+aneurysm.">Mouse models for abdominal aortic aneurysm.</a> British Journal of Pharmacology. 179 (5), 792-810 (2022).</li><li>Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+three-dimensional+lumen+volume+ultrasound+is+a+sensitive+method+to+detect+early+aneurysmal+change+in+elastase-induced+murine+abdominal+aortic+aneurysm.">High-frequency three-dimensional lumen volume ultrasound is a sensitive method to detect early aneurysmal change in elastase-induced murine abdominal aortic aneurysm.</a> Aorta. 9 (6), 215-220 (2020).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+angiotensin+II+infusion+using+osmotic+pumps+induces+aortic+aneurysms+in+mice.">Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).</li><li>Sawada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+imaging+of+the+thoracic+and+abdominal+aorta+in+mice+to+determine+aneurysm+dimensions.">Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59013 (2019).</li><li>Eilenberg, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+citrullination+as+a+novel+biomarker+and+target+to+inhibit+progression+of+abdominal+aortic+aneurysms.">Histone citrullination as a novel biomarker and target to inhibit progression of abdominal aortic aneurysms.</a> Translational Research. 233, 32-46 (2021).</li><li>Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+dissection+precedes+formation+of+aneurysms+and+atherosclerosis+in+angiotensin+II-infused,+apolipoprotein+E-deficient+mice.">Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (9), 1621-1626 (2003).</li><li>Trachet, B., Fraga-Silva, R. A., Jacquet, P. A., Stergiopulos, N., Segers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence,+severity,+mortality,+and+confounding+factors+for+dissecting+AAA+detection+in+angiotensin+II-infused+mice:+A+meta-analysis.">Incidence, severity, mortality, and confounding factors for dissecting AAA detection in angiotensin II-infused mice: A meta-analysis.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 159-170 (2015).</li><li>Cesarovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+and+sevoflurane+provide+equally+effective+anaesthesia+in+laboratory+mice.">Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice.</a> Laboratory Animals. 44 (4), 329-336 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen revelaciones.

El modelo Ang-II es uno de los modelos de ratón AAA más utilizados debido a sus bajas exigencias técnicas y características particulares que se asemejan a la enfermedad humana 3,6. El tiempo de cirugía es de aproximadamente 10 minutos por animal, y la implantación de la bomba subcutánea es bien tolerada por los ratones si el bolsillo subcutáneo es lo suficientemente ancho y se coloca bajo en la espalda del animal, lejos del sitio de la incisión, para no interferir con la cicatrización de la herida. Cuando la piel está apretada alrededor de la bomba, puede producirse irritación tisular, lo que puede causar inflamación y costras y potencialmente interrumpir el mecanismo de liberación de la bomba por presión osmótica. La medición del volumen de Ang-II que queda en la bomba en el momento del sacrificio de animales da una idea de si el Ang-II se liberó con éxito durante los 28 días.
El modelo Ang-II ha sido propuesto recientemente para ser muy adecuado para estudiar el aneurisma aórtico y la progresión de la disección, ya que exhibe semejanza con las características humanas de ambos6. Es importante destacar que probar candidatos a fármacos para bloquear la expansión aórtica e influir en la remodelación coincidiría con la demanda clínica actual. En nuestro entorno experimental, se definió un límite para la formación de aneurismas antes del inicio del tratamiento basado en un crecimiento de volumen del 125% en el día 8 en relación con la línea de base, lo que explica la variación natural en el tamaño absoluto de la aorta en ratones. El umbral y el punto de tiempo se derivaron de un curso de tiempo inicial que confirmó la destrucción de la pared de la aorta en histología (datos no mostrados) y resultó en rupturas del 35% y 56% de AAA observados antes de la implantación del catéter. Si bien se aplicó un umbral mínimo de enfermedad establecida para la inclusión en el estudio, posteriormente se observó que un alto grado de expansión inicial de la aorta también puede limitar la aplicabilidad experimental. Los aneurismas que progresaron rápidamente a >200% de volumen para el día 8 no crecieron más allá de ese tamaño en el 55% de los casos (Figura 1D). Esto debe tenerse en cuenta durante el diseño experimental y el cálculo del tamaño de la muestra, ya que podría enmascarar el verdadero efecto de un tratamiento. Otra faceta de este modelo son las frecuentes roturas aórticas (torácicas o abdominales), que ocurren a tasas del 20%-40% y en su mayoría dentro de los primeros 10 días después de la implantación de la bomba Ang-II 3,18,19. Por lo tanto, al elegir el inicio del tratamiento para el día 9, se logró una alta tasa de aneurismas establecidos, y el cateterismo de la vena yugular se realizó esencialmente en ratones que se esperaba que sobrevivieran hasta el final del experimento (solo 3/24 ratones en nuestro grupo de control histórico se rompieron después del día 9), ahorrando así tiempo, esfuerzo, y costo.
Aparte de las roturas de la aorta, que constituyen una condición grave, la implantación concurrente del catéter con botón de acceso vascular y la bomba osmótica fue bien tolerada por los ratones, sin efecto notable sobre la movilidad o el comportamiento después de la recuperación de la cirugía. El procedimiento de cateterismo de la vena yugular debe tomar aproximadamente 30 minutos para los investigadores capacitados. La duración de la exposición a la anestesia (isoflurano) debe mantenerse al mínimo, y la frecuencia respiratoria del animal debe ser monitoreada de cerca para prevenir la depresión respiratoria, que puede conducir a un desenlace fatal si no se resuelve20. La pérdida de sangre después de perforar la vena yugular para la inserción del catéter, lo que lleva a la muerte del animal si es importante, podría ocurrir potencialmente cuando la vena yugular no está ligada adecuadamente cranealmente o una rama lateral que alimenta el área aislada del vaso no está cerrada. En ese caso, se debe aplicar presión con un hisopo de algodón al sitio de punción hasta que la fuga de sangre disminuya o se detenga, luego la inserción y ligadura del catéter debe hacerse lo más rápido posible; Una pequeña porción del apósito de colágeno para heridas se puede utilizar temporalmente para ayudar con la hemostasia.
La permeabilidad del catéter es uno de los factores más importantes, ya que la desconexión del catéter de la vena o del botón de acceso da como resultado una administración inadecuada del fármaco donde el fármaco se filtra en el espacio subcutáneo. Siguiendo la recomendación del fabricante de una superposición mínima de 3 mm entre el catéter y el conector metálico, solo se registró un caso de desconexión del catéter en el lado del botón (indicado por el líquido inyectado que se escapa del sitio de la incisión en el botón) durante 3 años en este modelo (2020-2021, n = 73), que se solucionó abriendo la herida y restableciendo la conexión en la cirugía. Además, se experimentó una tasa de fracaso de la permeabilidad del catéter de alrededor del 10% en nuestro grupo de control histórico de PBS (2/21) debido a la oclusión del catéter (lo que hace imposible la inyección), la desconexión del catéter de la vena (indicada por hinchazón aparente en el cuello durante la inyección) o complicaciones de cicatrización de heridas. Estos problemas pueden estar relacionados con lesiones autoinfligidas, es decir, arañazos o mordeduras de ratón. En particular, los tratamientos farmacológicos que interfieren con la cicatrización de heridas pueden aumentar las tasas de fracaso. Los pasos de solución de problemas para mejorar la tasa de permeabilidad incluyen aumentar la longitud del catéter insertado en la vena, asegurarse de que las ligaduras estén firmemente anudadas alrededor del catéter y la vena, y aplicar la técnica de presión positiva siguiendo la recomendación del fabricante, como se describe en el paso 2.12.10., durante la inyección. Además, la permeabilidad del catéter debe verificarse en el momento del sacrificio del animal mediante disección e inspección visual bajo el microscopio. Cabe destacar que el volumen diario de solución inyectada de drogas debe considerarse cuidadosamente. Como el volumen plasmático regula la presión arterial, el volumen de inyección puede afectar la expansión de AAA y, por lo tanto, los animales de control deben recibir el procedimiento simulado con volumen portador. Según nuestra experiencia (y observaciones no publicadas), una cantidad diaria de hasta 250 μL de PBS parece ser bien tolerada. Finalmente, similar a la implantación de la bomba, la irritación de la piel puede ocurrir alrededor del botón de acceso vascular implantado. Si se observa inflamación acompañada de tejido desvitalizado o necrótico, el desbridamiento de la herida debe llevarse a cabo mediante la eliminación de tejido no viable (el tejido necrótico a menudo se separará naturalmente de la herida), y la piel debe suturarse si es necesario; Si la inflamación y la necrosis son extensas, el bienestar del animal y los criterios de valoración humanitarios deben considerarse de acuerdo con las pautas.
La implantación dorsal simple y doble de la bomba osmótica y/o el VAS no interfirió con la señal de ultrasonido ni con la fijación del ratón en una posición adecuada en la etapa de ultrasonido. La adquisición automatizada de 157 fotogramas de más de 12 mm para renderizar una imagen 3D de la aorta para la medición del volumen es un procedimiento simple y rápido14, que solo requiere garantizar que la aorta esté libre de interferencias sobre el área de interés. Una trampa en este contexto es aplicar demasiada presión con el transductor mientras se intenta limpiar la imagen de interferencia, lo que puede interrumpir la medición automatizada si la frecuencia respiratoria se ve afectada por la compresión de las costillas cuando se registran imágenes del extremo craneal de la aorta abdominal. El diámetro se mide tradicionalmente en imágenes adquiridas mediante el modo B por el operador buscando manualmente el área de diámetro máximo mientras realiza el análisis de ultrasonido. Un avance en las imágenes en modo B son las imágenes EKV, que pueden resolver pequeños movimientos aórticos para producir una imagen lenta y de alta calidad de la aorta pulsante. Además, el diámetro aórtico máximo se puede determinar a partir de los fotogramas 3D adquiridos, donde las 157 imágenes ofrecen una visión general completa de la aorta tomada en sístole (debido al desencadenante del ECG establecido).
En conclusión, el protocolo compilado presentado proporciona un flujo de trabajo confiable y reproducible para la administración de fármacos intravenosos en un modelo de ratón de AAA inducido por Ang-II y para monitorear el tamaño aórtico por ultrasonido 3D. Los puntos de tiempo de monitoreo y operación se pueden ajustar a las necesidades específicas, y el cateterismo de la vena yugular se puede realizar por separado para cualquier configuración experimental que requiera la administración de sustancias específicas a través de inyecciones intravenosas. El VAS se puede usar alternativamente para muestreos de sangre repetidos si se usa una solución de bloqueo de catéter para prevenir la coagulación. El procedimiento de ultrasonido 3D descrito puede adaptarse para medir la aorta infrarrenal, donde se desarrollan aneurismas tras una lesión aguda en elastasa o modelos de ratón basados en CaCl2 de AAA. Si bien la adquisición de ultrasonido 3D tiene la ventaja de brindar una visión general de la región de la aorta afectada y la morfología del aneurisma, la adquisición de imágenes requiere más tiempo y, por lo tanto, puede ser más costosa. Otra limitación del protocolo que debe reconocerse es la necesidad de que los animales sean anestesiados brevemente para inyecciones intravenosas, mientras que la administración intraperitoneal generalmente se realiza en ratones conscientes.

Un aneurisma aórtico abdominal (AAA) es una dilatación patológica de un vaso debido a procesos inflamatorios y destructivos de tejidos en la pared aórtica que finalmente pueden conducir a la ruptura y la muerte del paciente. A pesar de los logros considerables en la reparación quirúrgica de AAA, hasta la fecha falta un tratamiento farmacológico conservador para bloquear la progresión de la expansión del aneurisma y potencialmente reducir el riesgo de ruptura. Se han desarrollado modelos animales para dilucidar los desencadenantes y mediadores de la enfermedad y para probar nuevos enfoques de terapia. Los modelos de ratón de AAA se aplican ampliamente y cubren las diferentes observaciones del tejido humano. Debido a sus diferencias pathomechanísticas, a menudo se aplica más de un modelo para investigar la función particular de las moléculas/vías o la eficacia de posibles fármacos terapéuticos 1,2. Entre los modelos más utilizados de inducción de AAA se encuentra la administración de angiotensina-II (Ang-II) en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE KO)3, que tiene una patogénesis más crónica en comparación con los modelos que se basan en la formación de aneurismas a partir de un insulto agudo a la pared aórtica 4,5. Por lo tanto, el modelo Ang-II parece particularmente adecuado para monitorear la progresión de la enfermedad y recientemente se demostró que se parece mucho a la enfermedad AAA humana en lo que respecta a las respuestas metabólicas e inflamatorias6. En particular, el modelo Ang-II presenta no solo el desarrollo de AAA, sino también la formación de aneurismas torácicos, así como la disección aórtica con formación de trombos intramurales.
Los tratamientos dirigidos a atacar la progresión de AAA ya establecido en lugar de prevenir el inicio de la enfermedad pueden tener mayor valor traslacional ya que los pacientes presentan una condición preexistente que requiere tratamiento 7,8. Para un diseño experimental comparable, el tamaño aórtico debe ser monitoreado antes y después de la inducción AAA para definir un umbral de desarrollo de la enfermedad y potencialmente estratificar a los ratones en grupos de tratamiento.
El modo de administración del fármaco depende de la absorción y estabilidad de la sustancia respectiva. Las inyecciones intraperitoneales (i.p.) se utilizan con mayor frecuencia debido a su facilidad de aplicación, no requieren anestesia y la falta de restricciones de volumen de inyección9. Sin embargo, la farmacocinética debe tenerse en cuenta al elegir la vía de administración, ya que las sustancias administradas i.p. se absorben principalmente a través de la circulación portal hepática y pueden sufrir metabolismo hepático antes de alcanzar la circulación, lo que podría dar lugar a concentraciones plasmáticas variables dependiendo del efecto de primer paso10. La inyección intravenosa (i.v.) produce la mayor biodisponibilidad de sustancias, y el desafío del acceso intravenoso repetitivo puede ser evitado por el uso de catéteres y puertos de acceso vascular para la administración diaria11,12,13. Con respecto al entorno AAA, la distribución del fármaco en circulación facilita la exposición directa al aneurisma a concentraciones definidas.
Aquí, describimos un flujo de trabajo para inducir AAA en el modelo de ratón Ang-II a través de la implantación subcutánea de una bomba osmótica, para el tratamiento diario de medicamentos intravenosos a través de un puerto de acceso vascular conectado a un catéter insertado en la vena yugular externa, así como para el monitoreo del tamaño del aneurisma a través de ultrasonido 3D14 a pesar de la presencia de dos implantes dorsales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Polysorb sutures</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>GL-46-MG</td>
			<td>Braided absorbable suture CV-23 Taper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>639H</td>
			<td>PERMA-HAND Silk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALZET 2004 osmotic pumps</td>
			<td>DURECT Corp</td>
			<td>298</td>
			<td>Osmotic mini pumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin-II</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4006473.0100</td>
			<td>Angiotensin II acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel</td>
			<td>Parker Labs</td>
			<td>PUSG-0308</td>
			<td>Ultrasound gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadona Wound Spray</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td>Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona Solution</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>15973</td>
			<td>Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter for mouse femoral vein/artery</td>
			<td>Instech Laboratories Inc</td>
			<td>C10PU-MFV1301</td>
			<td>1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removal cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handling tool</td>
			<td>Instech Laboratories Inc</td>
			<td>VABMG</td>
			<td>Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYLO NIGHT Eye Oinment</td>
			<td>URSAPHARM</td>
			<td>538922</td>
			<td>Eye lubricant cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles and syringes of various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZ51 Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Dissection and inspection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PinPort injectors</td>
			<td>Instech Laboratories Inc</td>
			<td>PNP3M-50</td>
			<td>Injector for vascular access button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective aluminum cap</td>
			<td>Instech Laboratories Inc</td>
			<td>VABM1C</td>
			<td>Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signa Electrode Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Labs</td>
			<td>PE-1560</td>
			<td>Electrode gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surigcal and microsurgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasorb C</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher</td>
			<td>20482</td>
			<td>Collagen wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular access button (VAB)</td>
			<td>Instech Laboratories Inc</td>
			<td>VABM1B/22</td>
			<td>Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td>
			<td>51073-51</td>
			<td>Ultrasound system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab 5.6.1 software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasound analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo MX550D transducer</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Linear Array Transducer For Vevo 3100 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Mouse Handling Table</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td>
			<td>11436</td>
			<td>Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug treatment by central venous catheter in a mouse model of angiotensin ii induced abdominal aortic aneurysm and monitoring by 3d ultrasound

Dado que faltan opciones de tratamiento farmacéutico en el tratamiento clínico del aneurisma aórtico abdominal (AAA), se aplican modelos animales, en particular modelos de ratón, para avanzar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad e identificar posibles objetivos terapéuticos. La prueba de nuevos candidatos a fármacos para bloquear el crecimiento de AAA en estos modelos generalmente requiere la administración repetida de fármacos durante el curso del experimento. Aquí, describimos un protocolo compilado para la inducción de AAA, la inserción de un catéter intravenoso para facilitar la terapia prolongada y el monitoreo serial de AAA mediante ultrasonido 3D. Los aneurismas son inducidos en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE) por la liberación de angiotensina II durante 28 días de minibombas osmóticas implantadas por vía subcutánea en la espalda del ratón. Posteriormente, se realiza el procedimiento quirúrgico para el cateterismo de la vena yugular externa para permitir el tratamiento diario con medicamentos intravenosos o el muestreo repetido de sangre a través de un botón de acceso vascular subcutáneo. A pesar de los dos implantes dorsales, el monitoreo del desarrollo de AAA se facilita fácilmente mediante el análisis secuencial de ultrasonido 3D semiautomatizado, que proporciona información completa sobre la expansión del diámetro y el volumen aórtico y sobre la morfología del aneurisma, como se ilustra con ejemplos experimentales.

Los resultados representativos muestran el desarrollo y la progresión de los aneurismas suprarrenales monitoreados por ultrasonido al inicio del estudio, día 8 y día 27 (Figura 1A). Una tinción tricrómica (Figura 1B) de la aorta del día 27 en la Figura 1A ilustra aún más la morfología del aneurisma formado con disección de pared y trombo intramural. El volumen aórtico (mm3) se determinó en un tramo de 12 mm14, y el diámetro aórtico máximo se midió adicionalmente a partir de las imágenes EKV. Se estableció un umbral de crecimiento del volumen del 125% desde el inicio hasta el día 8 para definir el desarrollo inicial del aneurisma. Según los datos recopilados durante 2 años (2020-2021, n = 157), solo el 9% de los animales no lograron formar un AAA de acuerdo con este límite. Sin embargo, el 35% de los ratones experimentaron rupturas aórticas (torácicas o abdominales) antes de la implantación del catéter el día 9, lo que resultó en un total del 56% de los animales restantes con enfermedad AAA establecida susceptible de estratificación en grupos de tratamiento (Figura 1C). Cabe destacar que entre nuestros controles históricos de PBS (n = 21), los aneurismas se desarrollaron en diversos grados (rango: 128% -314%, promedio 199% ± 55% de crecimiento del volumen aórtico SD en el día 8). Es importante destacar que se observó una relación inversa entre la expansión inicial y la progresión posterior de la enfermedad, es decir, el 55% de los aneurismas de progresión rápida (>200% de crecimiento del volumen en el día 8) no progresaron más hasta el día 27, mientras que el 80% de los otros aneurismas (>125% y <200% de crecimiento del volumen en el día 8) continuaron expandiéndose hasta el final del experimento (Figura 1D).
Como se informó recientemente 14,17, los métodos descritos se han establecido, validado e implementado con éxito, por ejemplo, para documentar el efecto terapéutico de un inhibidor de la citrulinación de histonas (GSK484, para la inhibición de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos) en el bloqueo de la progresión de AAA establecido. Los ratones deficientes en ApoE recibieron Ang-II a 1000 ng / kg / min mediante bombas osmóticas implantadas por vía subcutánea durante 28 días. Los animales fueron estratificados 1:1 a GSK484 (0,2 μg/g/día) o tratamiento PBS basado en el volumen aórtico medido el día 8 y se sometieron al procedimiento de cateterismo de vena yugular el día 9. Las inyecciones de drogas se realizaron diariamente en un volumen de 10 μL/g de peso de ratón hasta el final del estudio17. La Figura 2 muestra resultados ecográficos ejemplares (n = 2/grupo) (curso temporal de volumen absoluto y relativo o expansión del diámetro), revelando que el tratamiento con GSK484 inhibió la progresión del AAA, mientras que los aneurismas continuaron agrandándose en ratones control.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64124/64124fig01.jpg"> Figura 1: Formación y progresión de AAA en el modelo de ratón Ang-II detectado por ultrasonido 3D. (A) La aorta suprarrenal se monitorizó mediante ecografía 3D al inicio (BL), día 8 (d8) y día 27 (d27) después de la implantación de la bomba Ang-II. El volumen se midió en un tramo de 12 mm de la aorta suprarrenal (157 cuadros) basado en una imagen reconstruida en 3D. El diámetro aórtico máximo se determinó a partir de imágenes EKV. (B) Tinción tricrómica de una sección transversal de la aorta del día 27 después del sacrificio del ratón y la recolección de órganos. La presencia de una disección de aorta está indicada por L1/L2 (lumen 1 y lumen 2), y el trombo intramural se denota por * en A y B. (C) Tasa de incidencia de AAA (>125% de crecimiento del volumen aórtico a partir de BL) en el día 8 y roturas aórticas dentro de los primeros 9 días (torácica o abdominal) a partir de un conjunto de datos recopilados durante 2 años (n = 157). (D) Frecuencia de progresión desde el día 8 hasta el día 27 de formación inicial rápida (crecimiento del volumen aórtico del >200% desde BL hasta el día 8) versus aneurismas de crecimiento moderado (crecimiento del volumen aórtico del >125% y <200% desde BL hasta el día 8) en ratones tratados con PBS (n = 21). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64124/64124fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64124/64124fig02.jpg"> Figura 2: Resultados ejemplares de la inhibición de la citrulinación de histonas para bloquear la progresión de AAA en el modelo Ang-II mediante inyección intravenosa de GSK484 o PBS a través del botón de acceso vascular . (A) Volumen aórtico (mm3) medido en un tramo de 12 mm de la aorta suprarrenal. (B) Crecimiento calculado del volumen aórtico desde el inicio (BL = 100%). (C) Diámetro aórtico máximo determinado a partir de imágenes EKV. (D) El crecimiento calculado del diámetro aórtico a partir de BL. Los datos de GSK484 se extrajeron de un estudio previamente publicado17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64124/64124fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

Este protocolo describe la implantación consecutiva de una bomba osmótica para inducir aneurisma aórtico abdominal mediante la liberación de angiotensina II en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE) y de un puerto de acceso vascular con un catéter de vena yugular para tratamiento farmacológico repetido. El monitoreo del desarrollo del aneurisma por ultrasonido 3D se lleva a cabo de manera efectiva a pesar de los implantes dorsales.

Tratamiento farmacológico mediante catéter venoso central en un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal inducido por angiotensina II y monitorización por ecografía 3D

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

El protocolo combina un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal que se asemeja a la enfermedad humana establecida y el tratamiento repetitivo a través de catéter intravenoso. Abordar la necesidad clínica de bloquear la progresión del aneurisma. El protocolo proporciona un flujo de trabajo completo para probar medicamentos para reducir la progresión del aneurisma en ratones, incluida información completa sobre la expansión del volumen y la morfología del diámetro aórtico.Además de ultrasonido 3D. La ecografía 3D se puede adaptar para medir la aorta infrarrenal donde se desarrollan los aneurismas en modelos de ratón menos basados en el gusto. El cateterismo de la vena yugular se puede utilizar para cualquier conjunto de inyecciones intravenosas que requieran.Después de anestesiar a 12 a 14 semanas de edad con deficiencia de APOE ratón de correo afeitarse el área pequeña en el lado superior izquierdo de la espalda, sobre el omóplato, aplique una solución de povidona yodada al 10% para desinfectar el área afeitada. Haga una incisión transversal de un centímetro en la piel de la parte superior de la espalda con un bisturí entre la línea espinal media y la línea escapular izquierda. Sujetar la piel con fórceps y usar tijeras curvas romas.Haga un bolsillo subcutáneo empujando hacia la extremidad posterior izquierda. Abra las tijeras y saque las tijeras abiertas del corte para ensanchar el bolsillo. Inserte suavemente la bomba en el bolsillo con el moderador de flujo hacia la cola para minimizar la posible interferencia de la angiotensina dos liberada por el sitio de la incisión.Luego cierre la herida con suturas interrumpidas absorbibles 4.0. Utilizando el sistema de acceso vascular. Prepare el catéter cortando los tres lados franceses a la longitud deseada y empujando el catéter sobre el conector metálico de calibre 22 del sistema de acceso vascular o EVA con al menos tres milímetros de superposición.Coloque la tapa de aluminio en el botón para proteger el puerto. Afeite el pelaje desde el lado derecho del cuello en el lado ventral y el lado derecho de la parte superior de la espalda de un ratón anestesiado. Luego aplique la solución de povidona yodada para desinfectar el área afeitada.Para la preparación de la vena yugular, haga una incisión transversal de piel súper clavicular de 0,5 centímetros en el lado derecho del cuello sobre la clavícula derecha. Use pinzas microquirúrgicas romas para separar el tejido conectivo y la grasa que expone la vena yugular externa. Evite desgarrar pequeños vasos sanguíneos en la grasa.Aísle cinco milímetros del vaso cerca de los músculos pectorales. Luego, diseccionar el tejido romo debajo de la vena usando micro pinzas dobladas y pasar a través de dos o tres de las ligaduras de seda 6.0. Meter las ligaduras y añadir una gota de solución salina al sitio.Para la implantación del botón, voltee el mouse y colóquelo en posición prona. Aplique la solución de povidona yodada para desinfectar el área afeitada. Haga una incisión sagital de un centímetro en la parte superior de la espalda con un bisturí entre las líneas espinal media y escapular derecha.Luego, use tijeras curvas romas para hacer un bolsillo circular ligeramente más grande que el tamaño del VAS alrededor del sitio de la incisión mediante disección roma. Use las tijeras curvas romas para hacer un túnel craneal sobre el hombro derecho hacia la incisión ventral en el cuello abriendo ligeramente las tijeras. Luego saca las tijeras abiertas y repite la acción a medida que se empuja más adentro.Una vez que el túnel ha llegado a la incisión ventral, pase a través de pinzas quirúrgicas desde la incisión ventral hasta la incisión dorsal. Conecte tres extremos franceses del catéter a la pinza y tire del catéter a través del túnel para que quede fuera de la incisión ventral del cuello y el EVA esté en su lugar en la incisión dorsal. Luego inserte el disco de fieltro quirúrgico VAS por vía subcutánea en la incisión en la parte posterior.Desenganche el catéter para verificar la permeabilidad usando el extremo de la horquilla de la herramienta de manipulación para quitar la tapa protectora de aluminio y use el extremo magnético para sostener el botón e inyecte solución salina o PBS con una jeringa de un mililitro conectada al inyector correspondiente hasta que el líquido se escape del extremo francés. Presione el botón caudalmente en el bolsillo y cierre la piel sobre el disco de fieltro de los VA debajo de la brida del VAS con dos suturas cuatro oh interrumpidas cranealmente. Para el cateterismo venoso, voltee el mouse hacia la posición supina y agregue una gota de solución salina al lado cortado.Separe las ligaduras y ate la primera ligadura alrededor del catéter y la vena yugular con dos o tres nudos lo más cranealmente posible para ligar la vena y anclar el catéter al exterior. Mueva la segunda ligadura lo más cerca posible de los músculos pectorales. Usando micro tijeras cortar un ángulo diagonal para crear un extremo afilado de modo que de tres a cinco milímetros del catéter queden en la vena.Luego perfore un agujero en la vena con una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro llena de solución salina tirando de la ligadura craneal asegurada y empujando la aguja paralela a la vena. Luego, inserte el catéter en la vena de la misma manera tirando de la ligadura craneal asegurada y deslizando el catéter en la vena con las pinzas dobladas. Empuje el catéter hasta que esté alineado con la vena.Ate la segunda ligadura sobre la región insertada del catéter con dos o tres nudos y verifique que no haya fugas de sangre. Cortar el extremo sobrante de ambas ligaduras con micro tijeras y añadir una gota de solución salina. Luego cierre la piel con suturas interrumpidas absorbibles 4.0.Inyecte al ratón con el volumen deseado de inhibidor o solución salina PBS como se demostró anteriormente. Mantenga la presión positiva sobre el émbolo mientras desconecta la jeringa del VAS. Monitorear a los ratones después de la recuperación.Usando el software de ultrasonido ajuste la configuración para ganar una profundidad de imagen de 30 DB a 9.0 milímetros y ancho a 8.08 milímetros. A continuación, agregue una gota de electrogel a cada uno de los cuatro electrocardiogramas o electrodos de ECG en el escenario y pegue las extremidades del ratón a ellos. Extienda gel de ultrasonido caliente en el abdomen del ratón y baje el transmisor para ponerlo en contacto con el abdomen.Identifique la aorta como un vaso circular de pulsación rápida. Localice la arteria renal izquierda y examine el área manualmente hasta 12 milímetros cranealmente para asegurarse de que no haya interferencias en el área de interés. Retorno a la arteria renal izquierda.Luego coloque la sonda a seis milímetros cranealmente de la arteria. Para la adquisición de ultrasonido 3D, configure la puerta respiratoria con un retraso del 25% y una ventana del 50% y el disparador de ECG a 50 milisegundos. Desde las opciones 3D, establezca la distancia de escaneo en 11,96 milímetros con un tamaño de paso de 0,076 milímetros.Después de adquirir 157 fotogramas, desplácese para verificar la calidad de la imagen antes de guardar la imagen. Para la adquisición de diámetro 2D, apague la activación respiratoria y el ECG y localice manualmente el área con el diámetro más grande en el tramo de 12 milímetros de la aorta suprarrenal. Presione el modo B en la pantalla y adquiera una imagen en modo B.Además, para la imagen EKV sin mover el transductor, adquiera una imagen EKV con la configuración estándar del sistema en el mismo sitio. El desarrollo y la progresión de los aneurismas superrenales se monitorizaron mediante ecografía al inicio del día ocho y del día 27. Una tinción tricrómica de la aorta del día 27 ilustra la morfología del aneurisma formado con disección de pared y trombo intramural.La tasa de incidencia de aneurisma aórtico abdominal o AAA en el octavo día y rupturas aórticas dentro de los primeros nueve días mostró que el 9% de los ratones no lograron formar un AAA. Sin embargo, el 35% de los ratones experimentaron roturas aórticas antes de la implantación del catéter, lo que resultó en un total del 56% de los ratones restantes con enfermedad AAA establecida que fue mínima a la estratificación en grupos de tratamiento. Se observó una relación inversa entre la expansión inicial y la progresión adicional de la enfermedad de los aneurismas de formación inicial rápida versus de crecimiento moderado en ratones tratados con PBS control.Los resultados ejemplares de la ecografía revelaron que el tratamiento con GSK 4 84 inhibió la progresión de AAA mientras que los aneurismas continuaron agrandándose y controlando ratones. La permeabilidad del catéter es esencial ya que la desconexión del catéter de la vena o el botón de acceso vascular da como resultado la administración del fármaco en el espacio subcutáneo con concentraciones desconocidas del fármaco en el sitio del aneurisma. Cuando se sacrifican ratones al final del experimento, el agua y otros tejidos se pueden investigar histológicamente y realizar análisis de sangre para caracterizar los efectos de los fármacos dentro y fuera del objetivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

Medicina

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