Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

كوبر والدكتور ليجون رونغ من جامعة إلينوي في شيكاغو على تقديم عينات الفيروس الزائف المستخدمة في هذا البروتوكول (SARS-CoV-2 و SARS-CoV-1 و H5N1) ، وكذلك الدكتور ألفارو هيرنانديز والدكتور كريس رايت من مرفق خدمات الحمض النووي التابع لمركز روي ج. كارفر للتكنولوجيا الحيوية بجامعة إلينوي في أوربانا شامبين لمساعدتهم في التسلسل عالي الإنتاجية ، والعديد من أعضاء مجموعة Lu الذين ساعدونا في الاختيار في المختبر وتقنيات توصيف الأبتامر. تم دعم هذا العمل بمنحة RAPID من المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET 20-29215) ومنحة أولية من معهد الاستدامة والطاقة والبيئة في جامعة إلينوي في أوربانا شامبين ومعهد إلينوي جيتري (JITRI 23965). تشكر A.S.P. زمالة PEW لأمريكا اللاتينية على الدعم المالي. كما نشكر مؤسسة روبرت أ. ويلش (Grant F-0020) على دعم برنامج أبحاث مجموعة Lu في جامعة تكساس في أوستن.

1. إعداد الكواشف والمخازن المؤقتة
<ol><li>قم بإعداد 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) بإضافة 0.9 M Tris-base ، 0.9 M حمض البوريك ، 20 mM EDTA (ملح الصوديوم) ، والماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي 1 L. امزج حتى تذوب جميع المكونات.</li>
	<li>قم بإعداد محلول مخزون بولي أكريلاميد لتغيير طبيعة 10٪ على النحو التالي. في زجاجة ...

لا يسمح SELEX فقط بتحديد الأبتامير ذات التقارب العالي ، في نطاق pM-nM22،43،44،45 ، ولكن أيضا مع انتقائية عالية وقابلة للضبط. من خلال الاستفادة من الاختيار المضاد ، يمكن الحصول على aptamers مع انتقائية صعبة. على سبيل المثال ، أثبتت م?...

للعدوى الفيروسية آثار اقتصادية واجتماعية هائلة في جميع أنحاء العالم ، كما أصبح واضحا بشكل متزايد من جائحة COVID-19 الأخيرة. التشخيص الدقيق في الوقت المناسب أمر بالغ الأهمية في علاج الالتهابات الفيروسية مع منع انتشار الفيروسات إلى الأشخاص الأصحاء. في حين تم تطوير العديد من طرق الكشف عن الفيروسات ، مثل اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل 1,2 ومقايساتinmunoassay 3 ، فإن معظم الطرق المستخدمة حاليا غير قادرة على تحديد ما إذا كان الفيروس المكتشف معديا بالفعل أم لا. وذلك لأن وجود مكونات الفيروس وحده ، مثل الحمض النووي الفيروسي أو البروتينات ، لا يشير إلى وجود الفيروس السليم والمعدي ، وقد أظهرت مستويات هذه المؤشرات الحيوية ارتباطا ضعيفا بالعدوى4،5،6. على سبيل المثال ، يحتوي الحمض النووي الريبي الفيروسي ، الذي يشيع استخدامه في اختبارات COVID-19 الحالية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، على مستويات منخفضة جدا في المراحل المبكرة من العدوى عندما يكون المريض معديا ، في حين أن مستوى الحمض النووي الريبي غالبا ما يكون مرتفعا جدا عندما يتعافى المرضى من العدوى ولم يعودوا معديين 7,8. يتبع البروتين الفيروسي أو المؤشرات الحيوية للمستضد اتجاها مشابها ، ولكنه يظهر عادة في وقت متأخر عن الحمض النووي الريبي الفيروسي وبالتالي فهو أقل تنبؤا بالعدوى 6,9. لمعالجة هذا القيد ، تم تطوير بعض الطرق التي يمكن أن تبلغ عن حالة العدوى للفيروس ، ولكنها تستند إلى تقنيات علم الأحياء الدقيقة لزراعة الخلايا التي تتطلب وقتا طويلا (أيام أو أسابيع) للحصول على النتائج 4,10. وبالتالي ، فإن تطوير أجهزة استشعار جديدة يمكنها الإبلاغ عن قابلية العدوى للعينات السريرية أو البيئية يمكن أن يتجنب التأخير في العلاج وزيادة انتشار الفيروس. ومع ذلك ، يمكن لعدد قليل جدا من الطرق الحصول على جزيئات استشعار يمكنها التعرف على virion المعدية السليمة وتمييزها عن نفس الفيروس الذي أصبح غير معدي.
في هذا السياق ، تعتبر الأبتامير مناسبة بشكل خاص كأداة جزيئية حيوية فريدة11،12،13،14. Aptamers عبارة عن جزيئات DNA أو RNA قصيرة مفردة تقطعت بها السبل مع تسلسل نيوكليوتيدات محدد يسمح لها بتكوين شكل ثلاثي الأبعاد محدد للتعرف على هدف ذو تقارب وانتقائية عالية15,16. يتم الحصول عليها من خلال عملية اختيار اندماجية تسمى التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX) ، المعروف أيضا باسم الانتقاء في المختبر ، والذي يتم إجراؤه في أنابيب اختبار مع مكتبة عينات عشوائية كبيرة من الحمض النووي من 10 14-1015 تسلسل 17،18،19. في كل جولة من هذه العملية التكرارية ، يتعرض تجمع الحمض النووي أولا لضغط اختيار من خلال الحضانة مع الهدف في ظل الظروف المطلوبة. ثم تتم إزالة أي تسلسلات غير مرتبطة بالهدف ، تاركة وراءها فقط تلك التسلسلات القليلة القادرة على الارتباط في ظل الظروف المحددة. أخيرا ، يتم تضخيم التسلسلات التي تم اختيارها في الخطوة السابقة بواسطة PCR ، مما يثري سكان التجمع بالتسلسلات الوظيفية المطلوبة للجولة التالية من الاختيار ، وتتكرر العملية. عندما يصل نشاط مجموعة الاختيار إلى هضبة (عادة بعد 8-15 جولة) ، يتم تحليل المكتبة عن طريق تسلسل الحمض النووي لتحديد التسلسلات الفائزة التي تظهر أعلى تقارب.
تتمتع SELEX بمزايا فريدة يمكن استغلالها للحصول على انتقائية متزايدة مقابل أهداف أخرى مماثلة 20,21 ، مثل حالة العدوى للفيروس22. أولا ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأنواع المختلفة من الأهداف للاختيار ، من الجزيئات الصغيرة والبروتينات إلى مسببات الأمراض والخلاياالكاملة 16. وبالتالي ، للحصول على أبتامير يرتبط بفيروس معدي ، يمكن استخدام فيروس سليم كهدف ، بدلا من بروتين السطح الفيروسي19. يسمح الفيروس الكامل SELEX باختيار aptamers التي ترتبط على وجه التحديد بالحالة الأصلية للفيروس ، دون الحاجة إلى تعطيل الفيروس. ثانيا ، يمكن تصميم SELEX خصيصا لإزالة الأهداف المتنافسة 21,23 ، مثل الفيروسات المماثلة الأخرى أو الفيروسات المعطلة غير المعدية ، باستخدام خطوات الاختيار المضادة في كل جولة من الاختيار22. أثناء خطوات الاختيار المضاد ، يتعرض تجمع الحمض النووي لأهداف لا يرغب في الارتباط بها ، ويتم تجاهل أي تسلسلات مرتبطة.
في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا يمكن تطبيقه بشكل عام لاختيار الأبتامير الذي يرتبط بفيروس معدي ولكن ليس بنفس الفيروس الذي أصبح غير معدي بواسطة طريقة تطهير معينة أو بفيروسات أخرى ذات صلة. تسمح هذه الطريقة بالحصول على عوامل التعرف بناء على الاختلافات الوظيفية لسطح الفيروس ، والتي لا تحتاج إلى معرفتها مسبقا ، وبالتالي توفر ميزة إضافية للكشف عن مسببات الأمراض الناشئة حديثا أو للأمراض غير المدروسة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

العدوى الفيروسية لها تأثير كبير على المجتمع. تواجه معظم طرق الكشف صعوبات في تحديد ما إذا كان الفيروس المكتشف معديا ، مما يتسبب في تأخير العلاج وزيادة انتشار الفيروس. إن تطوير أجهزة استشعار جديدة يمكنها الإبلاغ عن قابلية العدوى للعينات السريرية أو البيئية سيواجه هذا التحدي الذي لم تتم تلبيته بعد. ومع ذلك ، يمكن لعدد قليل جدا من الطرق الحصول على جزيئات استشعار يمكنها التعرف على فيروس معد سليم وتمييزه عن نفس الفيروس الذي أصبح غير معدي بطرق التطهير. هنا ، نصف بروتوكولا لاختيار الأبتامير يمكنه التمييز بين الفيروسات المعدية والفيروسات غير المعدية باستخدام التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX). نحن نستفيد من ميزتين من SELEX. أولا ، يمكن تصميم SELEX خصيصا لإزالة الأهداف المنافسة ، مثل الفيروسات غير المعدية أو الفيروسات المماثلة الأخرى ، باستخدام الاختيار المضاد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفيروس بأكمله كهدف ل SELEX ، بدلا من ، على سبيل المثال ، بروتين السطح الفيروسي. يسمح الفيروس الكامل SELEX باختيار الأبتامير التي ترتبط على وجه التحديد بالحالة الأصلية للفيروس ، دون الحاجة إلى تعطيل الفيروس. وبالتالي تسمح هذه الطريقة بالحصول على عوامل التعرف بناء على الاختلافات الوظيفية في سطح مسببات الأمراض ، والتي لا تحتاج إلى معرفتها مسبقا.

نظرا لأنه يمكن الحصول على أبتامير الحمض النووي باستخدام SELEX في أنبوب اختبار15 ، فقد تم تصميم استراتيجية SELEX هذه بعناية لتشمل كلا من خطوات الانتقاء الإيجابي نحو الفيروس المعدي الكامل السليم (أي الاحتفاظ بجزيئات الحمض النووي التي ترتبط بالفيروس المعدي) ، وكذلك خطوات الاختيار ال?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

نحن نقدم بروتوكولا يمكن تطبيقه بشكل عام على مجموعة مختارة من الأبتامير التي ترتبط بالفيروسات المعدية فقط وليس للفيروسات التي أصبحت غير معدية بطريقة التطهير أو أي فيروسات أخرى مماثلة. هذا يفتح إمكانية تحديد حالة العدوى في الاختبارات المحمولة والسريعة.

في المختبر اختيار أبتامر للتمييز بين الفيروسات المعدية وغير المعدية

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

يصف هذا البروتوكول كيفية اختيار أبتامير الحمض النووي التي يمكنها التمييز بين الفيروسات المعدية والفيروسات غير المعدية من أجل الحصول على جزيء استشعار قادر على إبلاغ قابلية العدوى للعينات السريرية أو البيئية. يمكن تطبيق هذه التقنية للحصول على أبتامير انتقائي للعديد من الفيروسات الأخرى ، بما في ذلك الفيروسات الناشئة ، لأنها لا تتطلب معرفة مسبقة بهياكل الفيروس أو تسلسله. تسمح هذه التقنية بتطوير مستشعرات أبتامر للتشخيص السريري والمراقبة البيئية للفيروسات المعدية لاكتشاف ما إذا كان شخص ما معديا أو إذا كانت طريقة التطهير البيئي تعمل على النحو المنشود.يمكن أن يكون الاختيار عملية صعبة ، خاصة بالنسبة لأولئك الجدد عليها. من المهم تحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل ومراقبة تقدم الاختيار باستخدام qPCR. سيوضح الإجراء ماركوس جراماجو ، طالب دراسات عليا من مختبري.للبدء ، قم بتصميم مكتبة وبادئات أولية مفردة تقطعت بهم السبل أو SS-DNA. الحصول على oligos الحمض النووي من مصادر تجارية مع تنقية تحلية قياسية. تنقية مكتبة SS-DNA والاشعال على 10 ٪ تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد الكهربائي تليها ترسيب الإيثانول.بعد ذلك ، احصل على محلول مخزون من الفيروسات المعدية وغير المعدية أو قم بإعدادها كما هو موضح في مخطوطة النص. لتمسخ مكتبة SS-DNA ، امزج 10 ميكرولتر من مكتبة SS-DNA 100 ميكرومولار مع 240 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام جاف ، ثم ضع الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة.امزج 250 ميكرولترا من مكتبة SS-DNA في مخزن SELEX المؤقت مع 50 ميكرولترا من الفيروسات المعدية للاختيار الإيجابي. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 400 ميكرولتر من تسلسل T20 الملي واحد إلى مرشح 0.5 ملليلتر لمنع المواقع غير المحددة.احتضان المرشحات لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي مرشح في 14،000 غرام لمدة 10 دقائق لإزالة حل T20. ثم اغسل الفلتر ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت SELEX لإزالة تسلسلات T20 الزائدة.بعد ذلك ، أضف خليط الفيروسات المعدية في مكتبة SS-DNA إلى مرشح 100 كيلودالتون المحظور وأجهزة الطرد المركزي لغسل التسلسلات غير المنضمة. اغسل الفلتر ثلاث مرات بإضافة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX والطرد المركزي. احتفظ بالكسر في الفلتر وتجاهل التدفق.لإلغاء التسلسلات المرتبطة ، قم بتغيير أنبوب التجميع لمرشح الطرد المركزي وأضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX الذي يحتوي على ثمانية اليوريا المولية إلى الفلتر. سخني الفلتر عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم استخدم جهاز طرد مركزي لجمع التدفق الذي يحتوي على التسلسلات المستخلصة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، اغسل المواد باستخدام 10٪ مبيض.بعد ذلك ، أضف محلول الفيروس المعدي SS-DNA الذي تم جمعه في الخطوة السابقة إلى مرشح 10 كيلودالتون المحظور ، وأجهزة الطرد المركزي عند 14،000 جم لمدة 15 دقيقة وتجاهل التدفق. اغسل الفلتر ثلاث مرات ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX لإزالة اليوريا عن طريق الطرد المركزي وتجاهل التدفق. استرجع المحلول في المرشح عن طريق قلبه رأسا على عقب في أنبوب تجميع نظيف والطرد المركزي لمدة خمس دقائق.قم بقياس الحجم النهائي للمحلول المستعاد باستخدام ماصة وقم بتسميته كعينة مستديرة 1A. خذ 90٪ من عينة الجولة 1A كقالب في الجولة الأولى وقم بتشغيل PCR باستخدام ظروف محسنة. لاستعادة SS-DNA باستخدام حبات مغناطيسية معدلة من الستربتافيدين أو MB ، قم بتقسيم المنتج إلى 50 ميكرولتر من القسامات وإضافتها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 50 ميكرولتر MB. احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة مع تحريض خفيف في درجة حرارة الغرفة.ثم ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لعزل MB وإزالة المادة الطافية عن طريق الماصة. اغسل MB مرتين بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط والغسيل إلى الأنبوب. ثم قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي واضغط عليه قبل إعادة تعليق MB إلى محلول متجانس عن طريق الماصة.ضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق MB في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX وقم بتسخين المحلول عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع الأنبوب على الفور في الرف المغناطيسي واجمع المادة الطافية التي تحتوي على تجمع SS-DNA.كرر خطوة الاسترداد هذه بإضافة 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت SELEX. قم بقياس الحجم النهائي للكسر المسترد وقم بتسميته على أنه Round 1X. لتمسخ تجمع SS-DNA ، خذ 60٪ من عينة Round 1X واخلطها مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت SELEX.سخني العينة في حمام جاف ، ثم ضع الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، امزج تجمع SS-DNA المشوه في المخزن المؤقت SELEX مع 50 ميكرولترا من كل فيروس كخطوة اختيار مضادة واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد حظر المواقع غير المحددة في مرشحات أجهزة الطرد المركزي ، أضف الخليط المشوه SS-DNA المجمع المحتضن بمحلول فيروس إلى مرشح 100 كيلودالتون المحظور.أجهزة الطرد المركزي مرشح في 14،000 غرام لمدة 10 دقائق وجمع التدفق من خلال. خذ 300 ميكرولتر من الكسر واخلطه مع 50 ميكرولترا من الفيروسات المعدية التي تحتوي على 100 مليون نسخة لكل ملليلتر. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.قم بإعداد مزيج رئيسي قياسي من qPCR وتخفيفات مكتبة SS-DNA المنقاة كما هو موضح في النص. قم بتشغيل qPCR لتحديد دورة العتبة. بعد الجري ، استخدم منحنى قياسي لتحديد كمية SS-DNA في الجولة 1A والجولة 1X.ثم احسب ناتج الشطف باعتباره كمية الحمض النووي المربوطة مقسومة على كمية الحمض النووي الأولية وارسم ناتج الشطف مقابل الرقم الدائري. أخيرا ، ارسم منحنيات الذوبان لجولات مختلفة. للحصول على تسلسل عالي الإنتاجية ، حدد مجموعة مناسبة متاحة تجاريا.قم بإعداد مجموعات متعددة من جولات التحديد التي تمثل الإثراء العالي والمتوسط والمنخفض، بالإضافة إلى التجمع النهائي باستخدام زوج مختلف من الفهارس في المحولات لكل تجمع. ثم أرسل المكتبة النهائية المعدة إلى مرفق التسلسل. لتحليل التسلسل ، تم إلغاء تعدد التسلسلات بواسطة مرفق التسلسل.قم بإزالة محولات التسلسل وبادئات التحديد باستخدام برنامج سطر الأوامر Cutadapt. ثم استخدم برنامج FASTX-Toolkit لإزالة التسلسلات منخفضة الجودة. ثم ادمج ملفات التسلسل في الاتجاه العكسي مع تلك الموجودة في الاتجاه الأمامي باستخدام وظيفة FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ complement في ملفات الاتجاه العكسي.ثم استخدم برنامج CAT المدمج لدمج الملفات في ملف واحد. استخدم مجموعة أدوات تحليل FASTAptamer لتحليل إثراء التسلسلات عبر تجمعات التحديد المختلفة. أولا، لاستخدام عدد FASTAptamer ووظائف مجموعة FASTAptamer لتجميع التسلسلات المتشابهة في مجموعات.بعد ذلك ، استخدم وظيفة إثراء FASTAptamer للحصول على معلومات حول إثراء التسلسلات والمجموعات. تحديد تسلسلات أبتامير المرشحة من معلومات الإثراء التي تم الحصول عليها من خلال تحليل التسلسل. حدد عدة تسلسلات أبتامر وقم بإجراء الفحص الأولي باستخدام مقايسة الربط.في هذا التحليل ، تم استخدام qPCR لمراقبة تقدم SELEX من aptamers المعدية الخاصة ب SARS-CoV-2. زاد عائد الشطف في البداية مع كل جولة من SELEX واستوى عند الجولتين الثامنة والتاسعة. وبمقارنة منحنيات الانصهار، لوحظ تحول من الذروة عند درجة حرارة انصهار عالية من 77 إلى 79 درجة مئوية.علاوة على ذلك ، في الجولتين الأخيرتين ، لوحظت ذروة عند درجة حرارة انصهار منخفضة. يتم عرض الوفرة النسبية في القراءات لكل مليون لتسلسل SARS2 AR10 الذي تم الحصول عليه خلال جولات اختيار متتالية. أظهر الهيكل المتوقع ل SARS2 AR10 بنية ثانوية منظمة تحتوي على منطقة حلقة جذعية قد تشارك في التعرف على الفيروس.بمجرد الحصول على aptamers ، يمكن دمجها في البصريات الكهربائية ، وهو نوع آخر من أجهزة الاستشعار ، لتطوير اختبار الكشف السريع عن الفيروسات التي يمكن أن تبلغ عن عدوى الفيروس. نتصور أنه يمكن الحصول على أبتامير خاص بالمتغيرات المختلفة أو الصور النمطية للفيروس ، مما يجعل من الممكن المراقبة السريعة للمتغيرات التي تشكل أكبر تهديد للمجتمع.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

استخدام الميكروسكيل السيليكون الكابولي لتقييم مقلص الخلوية وظيفة<em&gt; في المختبر</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; بصري منصة لاختبار العدسات اللاصقة

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...