Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
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我们要感谢伊利诺伊大学芝加哥分校的Laura M. Cooper女士和Lijun Rong博士提供该协议中使用的假病毒样本（SARS-CoV-2，SARS-CoV-1，H5N1），以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校Roy J. Carver生物技术中心DNA服务设施的Alvaro Hernandez博士和Chris Wright博士在高通量测序方面的帮助， 以及Lu小组的许多成员，他们帮助我们进行 体外 选择和适配体表征技术。这项工作得到了美国国家科学基金会（CBET 20-29215）的RAPID资助以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校和伊利诺伊-JITRI研究所（JITRI 23965）的可持续、能源和环境研究所的种子资助。A.S.P. 感谢皮尤拉丁美洲奖学金的财政支持。我们还要感谢罗伯特·韦尔奇基金会（Grant F-0020）对德克萨斯大学奥斯汀分校Lu小组研究项目的支持。

1. 试剂和缓冲液的制备
<ol><li>通过加入 0.9 M 三硼碱、0.9 M 硼酸、20 mM EDTA（二钠盐）和去离子水至最终体积为 1 L 来制备 10x 三硼酸盐 EDTA（10x TBE）。</li>
	<li>制备10%变性聚丙烯酰胺储备溶液，如下所示。在 250 mL 玻璃瓶中，加入 120 g 尿素 （8 M）、25 mL 10x TBE、62.5 mL 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 （29：1） 溶液和足够的蒸馏水以达到 250 mL 的最终体积。混合直至所有成分溶解。</li>
	<li>准备2...

SELEX不仅可以鉴定pM-nM范围为22，43，44，45的高亲和力适配体，还可以鉴定具有高可调选择性的适配体。通过利用计数器选择，可以获得具有具有挑战性选择性的适配体。例如，Li小组已经证明能够获得能够区分致病性细菌菌株和非致病菌株的序列21。此外，Le等人鉴定出一种能够区分<...

病毒感染在世界各地具有巨大的经济和社会影响，最近的COVID-19大流行越来越明显。及时准确的诊断对于治疗病毒感染同时防止病毒传播给健康人至关重要。虽然已经开发了许多病毒检测方法，例如PCR测试1，2和免疫测定3，但目前使用的大多数方法都无法确定检测到的病毒是否真的具有传染性。这是因为仅存在病毒成分（例如病毒核酸或蛋白质）并不表明存在完整的传染性病毒，并且这些生物标志物的水平与感染性相关性较差4，5，6。例如，通常用于当前基于 PCR 的 COVID-19 测试的病毒 RNA 在感染的早期阶段患者具有传染性时水平非常低，而当患者从感染中康复并且不再具有传染性时，RNA 水平通常仍然很高7，8.病毒蛋白或抗原生物标志物遵循类似的趋势，但通常比病毒RNA出现得更晚，因此更不能预测感染性6，9。为了解决这一限制，已经开发了一些可以告知病毒感染状态的方法，但基于细胞培养微生物学技术，需要很长时间（几天或几周）才能获得结果4，10。因此，开发新的传感器，可以告知临床或环境样本的可感染性，可以避免治疗延误和病毒的进一步传播。然而，很少有方法可以获得能够识别完整感染性病毒粒子并将其与已变得非传染性的同一病毒区分开来的传感分子。
在这种情况下，核酸适配体特别适合作为独特的生物分子工具11，12，13，14。核酸适配体是具有特定核苷酸序列的短单链DNA或RNA分子，允许它们形成特定的3D构象以识别具有高亲和力和选择性的靶标15，16。它们是通过称为指数富集配体系统进化（SELEX）的组合选择过程获得的，也称为体外选择，该过程在具有10 14-1015序列的大型随机DNA采样文库的试管中进行 17，18，19.在该迭代过程的每一轮中，首先通过在所需条件下与靶标孵育来对DNA库进行选择压力。然后删除任何未与目标结合的序列，只留下那些在给定条件下能够结合的少数序列。最后，通过PCR扩增上一步中选择的序列，用下一轮选择所需的功能序列丰富池中的群体，并重复该过程。当选择池的活性达到平台期（通常在8-15轮后）时，通过DNA测序分析文库，以确定表现出最高亲和力的获胜序列。
SELEX具有独特的优势，可以利用这些优势来提高对其他类似靶标20，21的选择性，例如病毒22的感染性状态。首先，可以使用多种不同类型的靶标进行选择，从小分子和蛋白质到整个病原体和细胞16。因此，为了获得与感染性病毒结合的适配体，可以使用完整的病毒作为靶标，而不是病毒表面蛋白19。全病毒SELEX允许选择与病毒天然状态特异性结合的适配体，而无需破坏病毒。其次，SELEX可以定制以去除竞争靶标21，23，例如其他类似病毒或非传染性灭活病毒，使用每轮选择22中的计数器选择步骤。在计数器选择步骤中，DNA库暴露于不需要结合的靶标，并且任何结合的序列都被丢弃。
在这项工作中，我们提供了一种协议，该协议通常可用于选择与感染性病毒结合的适配体，但不能与通过特定消毒方法或另一种相关病毒结合的同一病毒结合。该方法允许基于病毒表面的功能差异获得识别剂，不需要事先知道，因此为检测新出现的病原体或研究不足的疾病提供了额外的优势。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

病毒感染对社会有重大影响;大多数检测方法难以确定检测到的病毒是否具有传染性，导致治疗延误和病毒进一步传播。开发能够告知临床或环境样本可感染性的新型传感器将应对这一未满足的挑战。然而，很少有方法可以获得能够识别完整传染性病毒并将其与通过消毒方法变得非传染性的同一病毒区分开来的传感分子。在这里，我们描述了一种选择适配体的方案，该适配体可以通过指数富集（SELEX）对配体进行系统进化来区分感染性病毒和非感染性病毒。我们利用了SELEX的两个功能。首先，SELEX 可以量身定制，以使用计数器选择来去除竞争目标，例如非传染性病毒或其他类似病毒。此外，整个病毒可以用作SELEX的靶标，而不是例如病毒表面蛋白。全病毒SELEX允许选择与病毒天然状态特异性结合的适配体，而无需破坏病毒。因此，该方法允许基于病原体表面的功能差异获得识别剂，而不需要事先知道。

由于DNA适配体可以在试管15中使用SELEX获得，因此该SELEX策略经过精心设计，既包括针对完整全传染性病毒的正向选择步骤（即保留与感染性病毒结合的DNA分子），也包括针对通过特定消毒方法变得无感染性的同一病毒的反选择步骤， 特别是紫外线处理，通过丢弃可以与非感染性病毒结合的DNA序列。选择过程的示意图如图 1所示。
作为?...

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In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

我们提供的方案通常可以应用于选择仅与感染性病毒结合的适配体，而不应用于通过消毒方法或任何其他类似病毒变得非传染性的病毒。这为在便携式和快速检测中确定感染性状态提供了可能性。

体外选择核酸适配体以区分感染性和非感染性病毒

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

该协议描述了如何选择可以区分感染性病毒和非感染性病毒的DNA适配体，以获得能够告知临床或环境样品可感染性的传感分子。该技术可用于获得许多其他病毒（包括新兴病毒）的选择性适配体，因为它不需要事先了解病毒的结构或序列。该技术允许开发用于传染性病毒的临床诊断和环境监测的适配体传感器，以检测某人是否具有传染性或环境消毒方法是否按预期工作。选择可能是一个艰难的过程，特别是对于那些刚接触它的人来说。优化PCR条件并使用qPCR监测选择进度非常重要。演示该程序的将是我实验室的研究生Marcos Gramajo。首先，设计初始单链或SS-DNA文库和引物。通过标准脱盐纯化从商业来源获得 DNA 寡核苷酸。在10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上纯化SS-DNA文库和引物，然后进行乙醇沉淀。接下来，获得传染性和非传染性病毒的储备溶液，或按照文本手稿中的说明制备它们。对于SS-DNA文库的变性，将10微升100微摩尔SS-DNA文库与240微升SELEX缓冲液混合。在干浴中将混合物在 95 摄氏度下加热 15 分钟，然后将管子放在冰上 15 分钟。将 SELEX 缓冲液中的 250 微升 SS-DNA 文库与 50 微升感染性病毒混合以进行正向选择。在室温下孵育两小时。然后将 400 微升的一毫摩尔 T20 序列添加到 0.5 毫升过滤器中以阻断非特异性位点。将过滤器孵育 30 分钟。将过滤器以14， 000 G离心10分钟以除去T20溶液。然后用SELEX缓冲液清洗过滤器三次，以去除多余的T20序列。接下来，将SS-DNA文库感染性病毒混合物添加到封闭的100千道尔顿过滤器中，并离心以洗涤未结合的序列。通过加入 400 微升 SELEX 缓冲液并离心来清洗过滤器三次。将馏分保留在过滤器中并丢弃流出物。要洗脱结合序列，请更换离心机过滤器的收集管，并向过滤器中加入含有8摩尔尿素的300微升SELEX缓冲液。将过滤器在95摄氏度下加热15分钟，然后离心以收集含有洗脱序列的流出物。完成后，用10%漂白剂清洗材料。接下来，将先前步骤中收集的SS-DNA感染性病毒溶液加入封闭的10千道尔顿过滤器中，以14， 000G离心15分钟并丢弃流出物。用 300 微升 SELEX 缓冲液清洗过滤器三次，通过离心除去尿素并丢弃流出物。通过在干净的收集管中将其倒置并离心五分钟来回收过滤器中的溶液。使用移液管测量回收溶液的最终体积，并将其标记为1A轮样品。在第一轮中取 90% 的 1A 轮样品作为模板，并使用优化的条件运行 PCR。要使用链霉亲和素修饰的磁珠或MB回收SS-DNA，请将产品分成50微升等分试样，并将它们添加到含有50微升MB的微量离心管中。将试管在室温下温和搅拌孵育 30 分钟。然后将试管放在磁性架上以分离MB并通过移液除去上清液。通过向管中加入 200 微升结合和洗涤缓冲液来洗涤 MB 两次。然后从磁性架上取下试管并敲击它，然后通过移液将 MB 重新悬浮到均匀的溶液中。将试管再次放在磁性架上并除去上清液。第二次洗涤后，将MB重悬于100微升SELEX缓冲液中，并在95摄氏度下加热溶液10分钟。立即将试管放入磁性架中并收集含有SS-DNA池的上清液。重复此恢复步骤，加入 50 微升 SELEX 缓冲液。测量回收馏分的最终体积并将其标记为第 1X 轮。对于SS-DNA池的变性，取60%的Round 1X样品并将其与50微升SELEX缓冲液混合。在干浴中加热样品，然后将试管放在冰上15分钟。接下来，将SELEX缓冲液中的变性SS-DNA池与50微升每种病毒混合作为反选择步骤，并在室温下孵育一小时。在离心机过滤器中封闭非特异性位点后，将与病毒溶液一起孵育的变性SS-DNA池的混合物加入封闭的100千道尔顿过滤器中。将过滤器以 14， 000 G 离心 10 分钟并收集流出物。取300微升馏分，与50微升感染性病毒混合，每毫升含有1亿拷贝。在室温下孵育两小时。如文中所述制备标准qPCR预混液和纯化的SS-DNA文库稀释液。运行 qPCR 以确定阈值循环。运行后，使用标准曲线量化第 1A 轮和第 1X 轮中的 SS-DNA 量。然后将洗脱率计算为结合的DNA量除以初始DNA量，并绘制洗脱产率与整数的关系图。最后，绘制不同轮次的熔化曲线。对于高通量测序，请选择适当的市售试剂盒。准备多个代表高、中和低富集的选择轮次池，以及使用适配器中每个池的不同索引对的最终池。然后将准备好的最终文库发送到测序设施。对于测序分析，测序工具对序列进行了解复用。使用命令行程序 Cutadapt 移除测序适配器和选择引物。然后使用 FASTX 工具包程序删除低质量序列。然后，使用反向文件的 FASTX-Toolkit FASTX_reverse_补码功能将反向序列文件与正向序列文件合并。然后使用内置的CAT程序将文件合并为单个文件。使用 FASTAptamer 分析工具包分析不同选择池中的序列富集情况。首先，使用 FASTAptamer 计数和 FASTAptamer 群集函数将相似的序列分组到群集中。接下来，使用 FASTAptamer 扩充函数获取有关序列和聚类富集的信息。从通过序列分析获得的富集信息中鉴定候选适配体序列。选择几个适配体序列并使用结合测定进行初步筛选。在该分析中，qPCR用于监测传染性SARS-CoV-2特异性适配体的SELEX进展。洗脱产率最初随着每一轮SELEX的增加而增加，并在第八轮和第九轮趋于平稳。通过比较熔化曲线，观察到在77至79摄氏度的高熔化温度下从峰值偏移。此外，在最后两轮中，观察到低熔点温度下的峰值。显示了在连续选择轮次中获得的测序SARS2 AR10的每百万读的相对丰度。SARS2 AR10的预测结构显示一个结构化的二级结构，其中包含可能参与识别病毒的茎环区域。一旦获得适配体，它们就可以被整合到电光学器件（另一种类型的传感器）中，以开发门户和快速病毒检测测试，从而告知病毒传染性。我们设想可以获得针对病毒的不同变体或刻板型的适配体，从而可以快速监测对社会构成最大威胁的变体。

Research

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