Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

Vi vil gerne takke Laura M. Cooper og Dr. Lijun Rong fra University of Illinois i Chicago for at levere de pseudovirusprøver, der anvendes i denne protokol (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), samt Dr. Alvaro Hernandez og Dr. Chris Wright fra DNA Services-faciliteten i Roy J. Carver Biotechnology Center ved University of Illinois i Urbana-Champaign for deres hjælp med high-throughput sekventering, og mange medlemmer af Lu-gruppen, der har hjulpet os med in vitro-udvælgelse og aptamerkarakteriseringsteknikker. Dette arbejde blev støttet af et RAPID-tilskud fra National Science Foundation (CBET 20-29215) og et frøtilskud fra Institute for Sustainability, Energy and Environment ved University of Illinois i Urbana-Champaign og Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. takker PEW Latin American Fellowship for økonomisk støtte. Vi takker også Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) for støtte til Lu-gruppens forskningsprogram ved University of Texas i Austin.

1. Fremstilling af reagenser og buffere
<ol><li>Forbered 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) ved at tilsætte 0,9 M Tris-base, 0,9 M borsyre, 20 mM EDTA (dinatriumsalt) og deioniseret vand til et endeligt volumen på 1 L. Bland indtil alle komponenter er opløst.</li>
	<li>Der fremstilles en 10% denaturerende polyacrylamidstamopløsning som følger. I en 250 ml glasflaske tilsættes 120 g urinstof (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% acrylamid / bisacrylamid (29: 1) opløsning og nok destilleret vand til at nå...

SELEX tillader ikke kun identifikation af aptamerer med høj affinitet i pM-nM-området 22,43,44,45, men også med høj og justerbar selektivitet. Ved at drage fordel af modvalg kan aptamerer med udfordrende selektivitet opnås. For eksempel har Li-gruppen demonstreret evnen til at opnå sekvenser, der kan differentiere patogene bakteriestammer fra ikke-patogene stammer21</su...

Virusinfektioner har enorme økonomiske og samfundsmæssige konsekvenser rundt om i verden, hvilket blev stadig tydeligere af den nylige covid-19-pandemi. Tidlig og præcis diagnose er altafgørende i behandling af virusinfektioner, samtidig med at spredning af vira til raske mennesker forhindres. Mens der er udviklet mange virusdetektionsmetoder, såsom PCR-test1,2 og inmunoassays3, er de fleste af de aktuelt anvendte metoder ikke i stand til at bestemme, om den påviste virus faktisk er smitsom eller ej. Dette skyldes, at tilstedeværelsen af komponenter i virussen alene, såsom viral nukleinsyre eller proteiner, ikke indikerer, at den intakte, infektiøse virus er til stede, og niveauer af disse biomarkører har vist dårlig korrelation med infektivitet 4,5,6. For eksempel har viralt RNA, der almindeligvis anvendes til de nuværende PCR-baserede COVID-19-tests, meget lave niveauer i de tidlige stadier af infektion, når patienten er smitsom, mens RNA-niveauet ofte stadig er meget højt, når patienterne er kommet sig efter infektionen og ikke længere er smitsomme 7,8. De virale protein- eller antigenbiomarkører følger en lignende tendens, men optræder typisk endnu senere end det virale RNA og er dermed endnu mindre prædiktive for infektibilitet 6,9. For at imødegå denne begrænsning er der udviklet nogle metoder, der kan informere om virusets infektivitetsstatus, men er baseret på cellekulturmikrobiologiske teknikker, der kræver lang tid (dage eller uger) for at opnå resultater 4,10. Udvikling af nye sensorer, der kan informere om inficerbarheden af kliniske eller miljømæssige prøver, kan således undgå forsinkelser i behandlingen og yderligere spredning af virussen. Imidlertid kan meget få metoder opnå sensormolekyler, der kan genkende en intakt infektiøs virion og differentiere den fra den samme virus, der er blevet gjort ikke-smitsom.
I denne sammenhæng er aptamerer særligt velegnede som et unikt biomolekylært værktøj11,12,13,14. Aptamers er korte, enkeltstrengede DNA- eller RNA-molekyler med en specifik nukleotidsekvens, der giver dem mulighed for at danne en specifik 3D-konformation for at genkende et mål med høj affinitet og selektivitet15,16. De opnås ved en kombinatorisk udvælgelsesproces kaldet systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX), også kendt som in vitro-selektion, der udføres i reagensglas med et stort tilfældigt DNA-prøveudtagningsbibliotek på 10 14-1015 sekvenser17,18,19. I hver runde af denne iterative proces udsættes DNA-puljen først for et selektionstryk gennem inkubation med målet under de ønskede betingelser. Alle sekvenser, der ikke er bundet til målet, fjernes derefter og efterlader kun de få sekvenser, der er i stand til at binde under de givne betingelser. Endelig forstærkes de sekvenser, der er valgt i det foregående trin, af PCR, hvilket beriger poolens population med de ønskede funktionelle sekvenser til den næste udvælgelsesrunde, og processen gentages. Når udvælgelsespuljens aktivitet når et plateau (typisk efter 8-15 runder), analyseres biblioteket ved DNA-sekventering for at identificere de vindende sekvenser, der udviser den højeste affinitet.
SELEX har unikke fordele, der kan udnyttes til at opnå øget selektivitet i forhold til andre lignende mål20,21, f.eks. for virussens smittestatus 22. For det første kan en lang række forskellige typer mål anvendes til udvælgelsen, fra små molekyler og proteiner til hele patogener og celler16. For at opnå en aptamer, der binder til en infektiøs virus, kan en intakt virus således anvendes som mål i stedet for et viralt overfladeprotein19. Hele virus SELEX giver mulighed for udvælgelse af aptamerer, der binder specifikt til virusets oprindelige tilstand uden behov for forstyrrelse af virussen. For det andet kan SELEX skræddersys til at fjerne konkurrerende mål 21,23, såsom andre lignende vira eller ikke-infektiøse inaktiverede vira, ved hjælp af modudvælgelsestrin i hver udvælgelsesrunde22. Under modudvælgelsestrinnene udsættes DNA-puljen for mål, for hvilke binding ikke ønskes, og eventuelle sekvenser, der binder, kasseres.
I dette arbejde leverer vi en protokol, der generelt kan anvendes til udvælgelse af aptamerer, der binder til en infektiøs virus, men ikke til den samme virus, der er gjort ikke-infektiøs ved en bestemt desinfektionsmetode eller til andre relaterede vira. Denne metode gør det muligt at opnå genkendelsesmidler baseret på funktionelle forskelle i virusoverfladen, som ikke behøver at være kendt på forhånd, og giver således en yderligere fordel til påvisning af nyligt fremkomne patogener eller til underundersøgte sygdomme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

Virusinfektioner har stor indvirkning på samfundet; De fleste metoder til påvisning har svært ved at afgøre, om en påvist virus er smitsom, hvilket forårsager forsinkelser i behandlingen og yderligere spredning af virussen. Udvikling af nye sensorer, der kan informere om inficerbarheden af kliniske eller miljømæssige prøver, vil imødekomme denne uopfyldte udfordring. Imidlertid kan meget få metoder opnå sensormolekyler, der kan genkende en intakt infektiøs virus og differentiere den fra den samme virus, der er gjort ikke-infektiøs ved desinfektionsmetoder. Her beskriver vi en protokol til udvælgelse af aptamerer, der kan skelne infektiøse vira vs ikke-infektiøse vira ved hjælp af systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX). Vi drager fordel af to funktioner i SELEX. For det første kan SELEX skræddersys til at fjerne konkurrerende mål, såsom ikke-infektiøse vira eller andre lignende vira, ved hjælp af modvalg. Derudover kan hele virussen bruges som mål for SELEX, i stedet for for eksempel et viralt overfladeprotein. Hele virus SELEX giver mulighed for udvælgelse af aptamerer, der binder specifikt til virusets oprindelige tilstand uden behov for at forstyrre virussen. Denne metode gør det således muligt at opnå genkendelsesmidler baseret på funktionelle forskelle i overfladen af patogener, som ikke behøver at være kendt på forhånd.

Da DNA-aptamerer kan opnås ved hjælp af SELEX i et reagensglas15, blev denne SELEX-strategi omhyggeligt udformet til at omfatte både positive selektionstrin mod det intakte, hele infektiøse virus (dvs. tilbageholde de DNA-molekyler, der binder til det infektiøse virus) samt modudvælgelsestrin for det samme virus, der er gjort ikke-infektiøst ved en bestemt desinfektionsmetode. specifikt UV-behandling, ved at kassere de DNA-sekvenser, der kan binde til den ikke-infektiøse virus. <strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Vi leverer en protokol, der generelt kan anvendes til udvalgte aptamerer, der kun binder til infektiøse vira og ikke til vira, der er gjort ikke-infektiøse ved en desinfektionsmetode eller til andre lignende vira. Dette åbner mulighed for at bestemme smittestatus i bærbare og hurtige test.

In vitro-udvælgelse af aptamerer til differentiering af infektiøse fra ikke-infektiøse vira

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Denne protokol beskriver, hvordan man vælger DNA-aptamerer, der kan skelne infektiøse vira versus ikke-infektiøse vira for at opnå sensormolekyle, der er i stand til at informere inkonfektabiliteten af kliniske eller miljømæssige prøver. Denne teknik kan anvendes til at opnå selektive aptamerer til mange andre vira, herunder nye vira, fordi den ikke kræver forudgående kendskab til virusets strukturer eller sekvenser. Denne teknik gør det muligt at udvikle aptamersensorer til klinisk diagnostisk og miljømæssig overvågning af infektiøse vira for at opdage, om nogen er smitsom, eller om en miljømæssig desinfektionsmetode fungerer efter hensigten.Udvælgelse kan være en vanskelig proces, især for dem, der er nye til det. Det er vigtigt at optimere PCR-betingelserne og overvåge status for udvælgelsen med qPCR. Marcos Gramajo, en kandidatstuderende fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren.Til at begynde med skal du designe det oprindelige enkeltstrengede eller SS-DNA-bibliotek og primere. Få DNA-oligoerne fra kommercielle kilder med standard afsaltningsoprensning. Rens SS-DNA-bibliotek og primere på 10% denaturerende polyacrylamidgelelektroforese efterfulgt af ethanoludfældning.Derefter opnås en stamopløsning af infektiøse og ikke-infektiøse vira eller forbereder dem som beskrevet i tekstmanuskriptet. Til denaturering af SS-DNA-bibliotek blandes 10 mikroliter 100 mikromolært SS-DNA-bibliotek med 240 mikroliter SELEX-buffer. Opvarm blandingen ved 95 grader Celsius i 15 minutter i et tørt bad, og læg derefter røret på is i 15 minutter.Bland 250 mikroliter SS-DNA-bibliotek i SELEX-buffer med 50 mikroliter infektiøs virus for positiv selektion. Inkuber i to timer ved stuetemperatur. Derefter tilsættes 400 mikroliter af en millimolær T20-sekvens til et 0,5 milliliter filter for at blokere de ikke-specifikke steder.Inkuber filtrene i 30 minutter. Centrifuger filteret ved 14.000 G i 10 minutter for at fjerne T20-opløsningen. Derefter vaskes filteret tre gange med SELEX-buffer for at fjerne overskydende T20-sekvenser.Derefter tilsættes SS-DNA-bibliotekets infektiøse virusblanding til det blokerede 100 kilodalton-filter og centrifugeres for at vaske ubundne sekvenser. Filteret vaskes tre gange ved tilsætning af 400 mikroliter SELEX-buffer og centrifugering. Opbevar fraktionen i filteret, og kassér gennemstrømningen.For at eluere bundne sekvenser skal centrifugefilterets opsamlingsrør udskiftes, og der tilsættes 300 mikroliter SELEX-buffer indeholdende otte molært urinstof til filteret. Filteret opvarmes til 95 grader Celsius i 15 minutter, og centrifugeres derefter for at opsamle gennemstrømningen indeholdende de eluerede sekvenser. Når du er færdig, vask materialerne med 10% blegemiddel.Derefter tilsættes SS-DNA-infektiøs virusopløsning opsamlet i det tidligere trin til et blokeret 10 kilodaltonfilter, centrifugeres ved 14.000 G i 15 minutter og kasseres gennemstrømningen. Filteret vaskes tre gange med 300 mikroliter SELEX-buffer for at fjerne urinstof ved centrifugering, og gennemstrømningen kasseres. Genvind opløsningen i filteret ved at vende den på hovedet i et rent opsamlingsrør og centrifugere i fem minutter.Mål det endelige volumen af den genvundne opløsning ved hjælp af en pipette og mærk den som en prøve i runde 1A. Tag 90% af runde 1A-prøven som skabelon i første runde, og kør PCR ved hjælp af optimerede forhold. For at genvinde SS-DNA ved hjælp af streptavidinmodificerede magnetiske perler eller MB, opdeles produktet i 50 mikroliter alikvoter og tilsættes dem til mikrocentrifugerør indeholdende 50 mikroliter MB. Inkuber røret i 30 minutter med mild omrøring ved stuetemperatur.Derefter anbringes tuben på magnetstativet for at isolere MB, og supernatanten fjernes ved pipettering. Vask MB to gange ved at tilsætte 200 mikroliter binding og vaskebuffer til røret. Fjern derefter røret fra magnetstativet, og bank på det, før du genopslæmmer MB til en homogen opløsning ved pipettering.Røret anbringes igen på magnetstativet, og supernatanten fjernes. Efter den anden vask resuspenderes MB i 100 mikroliter SELEX-buffer og opvarmes opløsningen til 95 grader Celsius i 10 minutter. Røret anbringes straks i magnetstativet, og supernatanten med SS-DNA-puljen opsamles.Gentag dette gendannelsestrin og tilsæt 50 mikroliter SELEX-buffer. Mål det endelige volumen af den genvundne fraktion, og mærk den som runde 1X. Til denaturering af SS-DNA-puljen skal du tage 60% af den runde 1X-prøve og blande den med 50 mikroliter SELEX-buffer.Opvarm prøven i et tørt bad, og læg derefter røret på is i 15 minutter. Bland derefter den denaturerede SS-DNA-pool i SELEX-buffer med 50 mikroliter af hver virus som modudvælgelsestrin og inkuber i en time ved stuetemperatur. Efter blokering af de ikke-specifikke steder i centrifugefiltre tilsættes blandingen denatureret SS-DNA-pulje inkuberet med en virusopløsning til et blokeret 100 kilodalton-filter.Centrifuger filteret ved 14.000 G i 10 minutter og opsaml gennemstrømningen. Tag 300 mikroliter fraktion og bland med 50 mikroliter infektiøs virus indeholdende 100 millioner kopier pr. Milliliter. Inkuber i to timer ved stuetemperatur.Forbered en standard qPCR-masterblanding og fortyndinger af oprenset SS-DNA-bibliotek som beskrevet i teksten. Kør qPCR for at bestemme tærskelcyklussen. Efter kørslen skal du bruge en standardkurve til at kvantificere mængden af SS-DNA i runde 1A og runde 1X.Beregn derefter elueringsudbyttet som den bundne DNA-mængde divideret med den oprindelige DNA-mængde, og plot elueringsudbyttet versus det runde tal. Til sidst plottes smeltekurverne for forskellige runder. For sekventering med højt gennemløb skal du vælge et passende kommercielt tilgængeligt sæt.Forbered flere puljer af udvælgelsesrunder, der repræsenterer høj, medium og lav berigelse, samt den endelige pulje ved hjælp af et andet par indekser i adapterne for hver pulje. Send derefter det forberedte endelige bibliotek til sekventeringsfaciliteten. Til sekventeringsanalyse er sekvenser blevet demultiplexeret af sekventeringsfaciliteten.Fjern sekventeringsadaptere og valgprimere ved hjælp af kommandolinjeprogrammet Cutadapt. Brug derefter FASTX-Toolkit-programmet til at fjerne sekvenser af lav kvalitet. Flet derefter sekvensfilerne i omvendt retning med dem i fremadgående retning ved hjælp af FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ komplementfunktionen på filerne i omvendt retning.Brug derefter det indbyggede CAT-program til at flette filerne til en enkelt fil. Brug FASTAptammer-analyseværktøjssættet til at analysere forbedringen af sekvenser på tværs af forskellige udvælgelsespuljer. For det første at bruge klyngefunktionerne FASTAptamer count og FASTAptamer til at gruppere lignende sekvenser i klynger.Brug derefter funktionen FASTAptamer enrich til at få oplysninger om berigelsen af sekvenser og klynger. Identificer kandidatens aptamersekvenser ud fra de berigelsesoplysninger, der er opnået ved sekvensanalyse. Vælg flere aptamersekvenser og udfør indledende screening ved hjælp af et bindingsassay.I denne analyse blev qPCR anvendt til at overvåge udviklingen af SELEX af infektiøse SARS-CoV-2-specifikke aptamerer. Elueringsudbyttet steg i begyndelsen for hver SELEX-runde og udjævnedes ved runde otte og ni. Ved at sammenligne smeltekurverne blev der observeret et skift fra toppen ved en høj smeltetemperatur fra 77 til 79 grader Celsius.Desuden blev der i de sidste to runder observeret en top ved en lav smeltetemperatur. Den relative forekomst i aflæsninger pr. million for den sekventerede SARS2 AR10 opnået over på hinanden følgende udvælgelsesrunder vises. Den forudsagte struktur af SARS2 AR10 viste en struktureret sekundær struktur, der indeholdt en stammesløjferegion, der kan være involveret i genkendelse af virussen.Når aptamerer er opnået, kan de inkorporeres i elektrisk optik, en anden type sensorer, for at udvikle portal- og hurtig virusdetekteringstest, der kan informere virusinfektivitet. Vi forestiller os, at aptamer, der er specifikke for forskellige varianter eller stereotyper af virus, kan opnås, hvilket gør det muligt hurtigt at overvåge varianter, der er den største trussel mod samfundet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylære Komplekser af negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Udnyttelse af Microscale Silicon udkragninger at Vurdere Cellular kontraktile funktion<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Udvikling af et<em&gt; In vitro</em&gt; Ocular Platform til Test Kontaktlinser

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...