Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

We willen mevrouw Laura M. Cooper en Dr. Lijun Rong van de Universiteit van Illinois in Chicago bedanken voor het verstrekken van de pseudovirusmonsters die in dit protocol worden gebruikt (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), evenals Dr. Alvaro Hernandez en Dr. Chris Wright van de DNA Services-faciliteit van het Roy J. Carver Biotechnology Center aan de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign voor hun hulp bij high-throughput sequencing, en veel leden van de Lu-groep die ons hebben geholpen met in vitro selectie en aptamer karakteriseringstechnieken. Dit werk werd ondersteund door een RAPID-subsidie van de National Science Foundation (CBET 20-29215) en een zaadsubsidie van het Institute for Sustainability, Energy and Environment aan de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign en Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. bedankt de PEW Latin American Fellowship voor de financiële steun. We bedanken ook de Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) voor de ondersteuning van het Lu-groepsonderzoeksprogramma aan de Universiteit van Texas in Austin.

1. Bereiding van reagentia en buffers
<ol><li>Bereid 10x Tris-boraat EDTA (10x TBE) door 0,9 M Tris-base, 0,9 M boorzuur, 20 mM EDTA (dinatriumzout) en gedeïoniseerd water toe te voegen tot een eindvolume van 1 L. Meng tot alle componenten zijn opgelost.</li>
	<li>Bereid als volgt een 10% denaturerende polyacrylamide-stockoplossing. Voeg in een glazen fles van 250 ml 120 g ureum (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) oplossing en voldoende gedestilleerd water toe om het uite...

SELEX maakt niet alleen de identificatie mogelijk van aptameren met een hoge affiniteit, in het pM-nM-bereik 22,43,44,45, maar ook met een hoge en instelbare selectiviteit. Door gebruik te maken van tegenselectie kunnen aptameren met uitdagende selectiviteit worden verkregen. De Li-groep heeft bijvoorbeeld het vermogen aangetoond om sequenties te verkrijgen die pathogene bacteriestammen kunnen...

Virusinfecties hebben enorme economische en maatschappelijke gevolgen over de hele wereld, zoals steeds duidelijker werd uit de recente COVID-19-pandemie. Tijdige en nauwkeurige diagnose is van het grootste belang bij de behandeling van virale infecties en voorkomt de verspreiding van virussen naar gezonde mensen. Hoewel er veel virusdetectiemethoden zijn ontwikkeld, zoals PCR-tests1,2 en inmunoassays3, zijn de meeste van de momenteel gebruikte methoden niet in staat om te bepalen of het gedetecteerde virus daadwerkelijk besmettelijk is of niet. Dit komt omdat de aanwezigheid van componenten van het virus alleen, zoals viraal nucleïnezuur of eiwitten, niet aangeeft dat het intacte, infectieuze virus aanwezig is, en niveaus van deze biomarkers hebben een slechte correlatie met infectiviteitaangetoond 4,5,6. Viraal RNA, dat vaak wordt gebruikt voor de huidige PCR-gebaseerde COVID-19-tests, heeft bijvoorbeeld zeer lage niveaus in de vroege stadia van infectie wanneer de patiënt besmettelijk is, terwijl het RNA-niveau vaak nog steeds erg hoog is wanneer patiënten zijn hersteld van de infectie en niet langer besmettelijk zijn 7,8. De virale eiwit- of antigeenbiomarkers volgen een vergelijkbare trend, maar verschijnen meestal zelfs later dan het virale RNA en zijn dus nog minder voorspellend voor de infecteerbaarheid 6,9. Om deze beperking aan te pakken, zijn enkele methoden ontwikkeld die kunnen informeren over de infectiviteitsstatus van het virus, maar zijn gebaseerd op celkweekmicrobiologische technieken die veel tijd (dagen of weken) nodig hebben om resultaten te verkrijgen 4,10. Zo kan het ontwikkelen van nieuwe sensoren die kunnen informeren over de infecteerbaarheid van klinische of omgevingsmonsters vertragingen in de behandeling en verdere verspreiding van het virus voorkomen. Er zijn echter maar weinig methoden die detectiemoleculen kunnen verkrijgen die een intact infectieus virion kunnen herkennen en onderscheiden van hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt.
In deze context zijn aptameren bijzonder geschikt als een uniek biomoleculair hulpmiddel11,12,13,14. Aptameren zijn korte, enkelstrengs DNA- of RNA-moleculen met een specifieke nucleotidesequentie waarmee ze een specifieke 3D-conformatie kunnen vormen om een doelwit met hoge affiniteit en selectiviteit te herkennen15,16. Ze worden verkregen door een combinatorisch selectieproces dat systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) wordt genoemd, ook bekend als in vitro selectie, dat wordt uitgevoerd in reageerbuizen met een grote willekeurige DNA-bemonsteringsbibliotheek van 10 14-1015 sequenties17,18,19. In elke ronde van dit iteratieve proces wordt de DNA-pool eerst onderworpen aan een selectiedruk door incubatie met het doelwit onder de gewenste omstandigheden. Alle sequenties die niet aan het doel zijn gebonden, worden vervolgens verwijderd, waardoor alleen die paar sequenties overblijven die onder de gegeven omstandigheden kunnen binden. Ten slotte worden de sequenties die in de vorige stap zijn geselecteerd, versterkt door PCR, waardoor de populatie van de pool wordt verrijkt met de gewenste functionele sequenties voor de volgende selectieronde en wordt het proces herhaald. Wanneer de activiteit van de selectiepool een plateau bereikt (meestal na 8-15 rondes), wordt de bibliotheek geanalyseerd door DNA-sequencing om de winnende sequenties te identificeren die de hoogste affiniteit vertonen.
SELEX heeft unieke voordelen die kunnen worden benut om verhoogde selectiviteit te verkrijgen ten opzichte van andere vergelijkbare doelen20,21, zoals voor de infectieiviteitsstatus van het virus22. Ten eerste kan een breed scala aan verschillende soorten doelen worden gebruikt voor de selectie, van kleine moleculen en eiwitten tot hele pathogenen en cellen16. Om dus een aptamer te verkrijgen die zich bindt aan een infectieus virus, kan een intact virus als doelwit worden gebruikt, in plaats van een viraal oppervlakte-eiwit19. Hele virus SELEX maakt de selectie van aptameren mogelijk die specifiek binden aan de oorspronkelijke toestand van het virus, zonder de noodzaak van verstoring van het virus. Ten tweede kan SELEX op maat worden gemaakt om concurrerende doelen 21,23, zoals andere soortgelijke virussen of niet-infectieuze geïnactiveerde virussen, te verwijderen met behulp van tegenselectiestappen in elke selectieronde22. Tijdens de tegenselectiestappen wordt de DNA-pool blootgesteld aan doelen waarvoor binding niet gewenst is en worden eventuele sequenties die binden weggegooid.
In dit werk bieden we een protocol dat algemeen kan worden toegepast voor het selecteren van aptameren die binden aan een infectieus virus, maar niet aan hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door een bepaalde desinfectiemethode of aan een ander verwant virus. Deze methode maakt het mogelijk om herkenningsmiddelen te verkrijgen op basis van functionele verschillen van het virusoppervlak, die niet van tevoren bekend hoeven te zijn, en biedt dus een extra voordeel voor de detectie van nieuw opgedoken pathogenen of voor onderbelichte ziekten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

Virusinfecties hebben een grote impact op de samenleving; De meeste detectiemethoden hebben moeite om te bepalen of een gedetecteerd virus besmettelijk is, wat vertragingen in de behandeling en verdere verspreiding van het virus veroorzaakt. Het ontwikkelen van nieuwe sensoren die kunnen informeren over de infecteerbaarheid van klinische of omgevingsmonsters zal deze onvervulde uitdaging aangaan. Er zijn echter maar weinig methoden die detectiemoleculen kunnen verkrijgen die een intact infectieus virus kunnen herkennen en het kunnen onderscheiden van hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door desinfectiemethoden. Hier beschrijven we een protocol om aptameren te selecteren die infectieuze virussen kunnen onderscheiden van niet-infectieuze virussen met behulp van systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX). We maken gebruik van twee functies van SELEX. Ten eerste kan SELEX op maat worden gemaakt om concurrerende doelwitten, zoals niet-infectieuze virussen of andere soortgelijke virussen, te verwijderen met behulp van tegenselectie. Bovendien kan het hele virus worden gebruikt als doelwit voor SELEX, in plaats van bijvoorbeeld een viraal oppervlakte-eiwit. Hele virus SELEX maakt de selectie van aptameren mogelijk die specifiek binden aan de inheemse toestand van het virus, zonder de noodzaak om het virus te verstoren. Met deze methode kunnen dus herkenningsmiddelen worden verkregen op basis van functionele verschillen in het oppervlak van pathogenen, die niet van tevoren bekend hoeven te zijn.

Aangezien DNA-aptameren kunnen worden verkregen met behulp van SELEX in een reageerbuis15, is deze SELEX-strategie zorgvuldig ontworpen om zowel positieve selectiestappen naar het intacte, hele infectieuze virus te omvatten (d.w.z. de DNA-moleculen te behouden die aan het infectieuze virus binden), als tegenselectiestappen voor hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door een bepaalde desinfectiemethode, specifiek UV-behandeling, door het weggooien van de DNA-sequenties die kunnen binden a...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

We bieden een protocol dat algemeen kan worden toegepast op het selecteren van aptameren die alleen binden aan infectieuze virussen en niet aan virussen die niet-infectieus zijn gemaakt door een desinfectiemethode of aan andere soortgelijke virussen. Dit opent de mogelijkheid om de infectiviteitsstatus te bepalen in draagbare en snelle tests.

In vitro selectie van aptameren om infectieuze van niet-infectieuze virussen te onderscheiden

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Dit protocol beschrijft hoe DNA-aptameren kunnen worden geselecteerd die infectieuze virussen kunnen onderscheiden van niet-infectieuze virussen om een detectiemolecuul te verkrijgen dat in staat is om de infecteerbaarheid van klinische of omgevingsmonsters te informeren. Deze techniek kan worden toegepast om selectieve aptameren te verkrijgen voor vele andere virussen, waaronder opkomende virussen, omdat het geen voorkennis van de structuren of sequenties van het virus vereist. Deze techniek maakt de ontwikkeling mogelijk van aptamer-sensoren voor klinische diagnose en omgevingsmonitoring van infectieuze virussen om te detecteren of iemand besmettelijk is of dat een omgevingsdesinfectiemethode werkt zoals bedoeld.Selectie kan een moeilijk proces zijn, vooral voor degenen die er nieuw in zijn. Het is belangrijk om de PCR-condities te optimaliseren en de voortgang van de selectie te monitoren met qPCR. Marcos Gramajo, een afgestudeerde student van mijn lab, demonstreert de procedure.Ontwerp om te beginnen de initiële enkelstrengs of SS-DNA-bibliotheek en primers. Verkrijg de DNA-oligo's uit commerciële bronnen met standaard ontzoutingszuivering. Zuiver de SS-DNA-bibliotheek en primers op 10% denaturerende polyacrylamidegel-elektroforese gevolgd door ethanolprecipitatie.Verkrijg vervolgens een stamoplossing van infectieuze en niet-infectieuze virussen of bereid ze voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voor denaturatie van de SS-DNA-bibliotheek, meng 10 microliter van 100 micromolaire SS-DNA-bibliotheek met 240 microliter SELEX-buffer. Verwarm het mengsel op 95 graden Celsius gedurende 15 minuten in een droog bad en plaats de buis vervolgens gedurende 15 minuten op ijs.Meng 250 microliter SS-DNA-bibliotheek in SELEX-buffer met 50 microliter infectieus virus voor positieve selectie. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter van één millimolaire T20-reeks toe aan een filter van 0,5 milliliter om de niet-specifieke locaties te blokkeren.Incubeer de filters gedurende 30 minuten. Centrifugeer het filter op 14.000 G gedurende 10 minuten om de T20-oplossing te verwijderen. Was het filter vervolgens driemaal met SELEX-buffer om overtollige T20-sequenties te verwijderen.Voeg vervolgens het SS-DNA-bibliotheekinfectieus virusmengsel toe aan het geblokkeerde 100 kilodaltonfilter en centrifuge om ongebonden sequenties te wassen. Was het filter driemaal door 400 microliter SELEX-buffer en centrifugatie toe te voegen. Houd de fractie in het filter en gooi de doorstroom weg.Om gebonden sequenties te elueren, vervangt u de opvangbuis van het centrifugefilter en voegt u 300 microliter SELEX-buffer met acht molair ureum toe aan het filter. Verwarm het filter gedurende 15 minuten op 95 graden Celsius en centrifugeer vervolgens om de doorstroming met de geëlueerde sequenties te verzamelen. Als je klaar bent, was je de materialen met 10% bleekmiddel.Voeg vervolgens de SS-DNA infectieuze virusoplossing die in de eerdere stap is verzameld toe aan een geblokkeerd 10 kilodaltonfilter, centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 G en gooi de doorstroom weg. Was het filter driemaal met 300 microliter SELEX-buffer om het ureum te verwijderen door centrifugeren en gooi de doorstroming weg. Recupereer de oplossing in het filter door deze ondersteboven te draaien in een schone opvangbuis en gedurende vijf minuten te centrifugeren.Meet het uiteindelijke volume van de teruggewonnen oplossing met behulp van een pipet en label het als een rond 1A-monster. Neem 90% van het Round 1A-monster als sjabloon in de eerste ronde en voer de PCR uit met behulp van geoptimaliseerde omstandigheden. Om SS-DNA te herstellen met behulp van streptavidin gemodificeerde magnetische kralen of MB, splitst u het product in 50 microliter aliquots en voegt u ze toe aan microcentrifugebuizen met 50 microliter MB. Incubeer de buis gedurende 30 minuten met milde agitatie bij kamertemperatuur.Plaats vervolgens de buis op het magnetische rek om de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren. Was de MB twee keer door 200 microliter bind- en wasbuffer aan de buis toe te voegen. Verwijder vervolgens de buis uit het magnetische rek en tik erop voordat u de MB opnieuw in een homogene oplossing brengt door pipetteren.Plaats de buis opnieuw op het magnetische rek en verwijder het supernatant. Na de tweede wasbeurt, resuspensie van de MB in 100 microliter SELEX buffer en verwarm de oplossing op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Plaats de buis onmiddellijk in het magnetische rek en verzamel het supernatant met de SS-DNA-pool.Herhaal deze herstelstap door 50 microliter SELEX-buffer toe te voegen. Meet het uiteindelijke volume van de teruggewonnen fractie en label het als Round 1X. Neem voor denaturatie van de SS-DNA-pool 60% van het Round 1X-monster en meng het met 50 microliter SELEX-buffer.Verwarm het monster in een droog bad en plaats de buis vervolgens gedurende 15 minuten op ijs. Meng vervolgens de gedenatureerde SS-DNA-pool in SELEX-buffer met 50 microliter van elk virus als tegenselectiestap en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na het blokkeren van de niet-specifieke locaties in centrifugefilters, voegt u het mengsel gedenatureerde SS-DNA-pool geïncubeerd met een virusoplossing toe aan een geblokkeerd 100 kilodaltonfilter.Centrifugeer het filter gedurende 10 minuten op 14.000 G en vang de doorstroming op. Neem 300 microliter fractie en meng met 50 microliter infectieus virus met 100 miljoen kopieën per milliliter. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Bereid een standaard qPCR-mastermix en verdunningen van gezuiverde SS-DNA-bibliotheek voor zoals beschreven in de tekst. Voer de qPCR uit om de drempelcyclus te bepalen. Gebruik na de run een standaardcurve om de hoeveelheid SS-DNA in ronde 1A en ronde 1X te kwantificeren.Bereken vervolgens de elutieopbrengst als de gebonden DNA-hoeveelheid gedeeld door de initiële DNA-hoeveelheid en plot de elutieopbrengst versus het ronde getal. Zet ten slotte de smeltcurves voor verschillende rondes uit. Voor high throughput sequencing selecteert u een geschikte in de handel verkrijgbare kit.Bereid meerdere pools van selectierondes voor die hoge, gemiddelde en lage verrijking vertegenwoordigen, evenals de uiteindelijke pool met behulp van een ander paar indexen in de adapters voor elke pool. Stuur vervolgens de voorbereide definitieve bibliotheek naar de sequencingfaciliteit. Voor sequencinganalyse zijn sequenties gedemultiplext door de sequencingfaciliteit.Verwijder de sequencingadapters en selectieprimers met het opdrachtregelprogramma Cutadapt. Gebruik vervolgens het FASTX-Toolkit-programma om sequenties van lage kwaliteit te verwijderen. Voeg vervolgens de sequentiebestanden in de omgekeerde richting samen met die in de voorwaartse richting met behulp van de FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ complementfunctie op de bestanden in omgekeerde richting.Gebruik vervolgens het ingebouwde CAT-programma om de bestanden samen te voegen tot één bestand. Gebruik de FASTAptamer-analysetoolkit om de verrijking van sequenties in verschillende selectiepools te analyseren. Ten eerste om de clusterfuncties FASTAptamer count en FASTAptamer te gebruiken om vergelijkbare sequenties in clusters te groeperen.Gebruik vervolgens de FASTAptamer-verrijkingsfunctie om informatie te krijgen over de verrijking van sequenties en clusters. Identificeer de kandidaat-aptamersequenties op basis van de verrijkingsinformatie die is verkregen door middel van sequentieanalyse. Selecteer verschillende aptamersequenties en voer een eerste screening uit met behulp van een bindingstest.In deze analyse werd qPCR gebruikt om de voortgang van SELEX van infectieuze SARS-CoV-2 specifieke aptameren te volgen. De elutieopbrengst nam aanvankelijk toe met elke ronde van SELEX en nivelleerde in ronde acht en negen. Door de smeltcurves te vergelijken, werd een verschuiving van de piek bij een hoge smelttemperatuur van 77 naar 79 graden Celsius waargenomen.Bovendien werd in de laatste twee rondes een piek bij een lage smelttemperatuur waargenomen. De relatieve abundantie in reads per miljoen voor de gesequentieerde SARS2 AR10 verkregen over opeenvolgende selectierondes wordt getoond. De voorspelde structuur van SARS2 AR10 toonde een gestructureerde secundaire structuur met daarin een stamlusgebied dat mogelijk betrokken is bij het herkennen van het virus.Zodra aptameren zijn verkregen, kunnen ze worden opgenomen in elektrische opticals, een ander type sensoren, om een portaal en een snelle virusdetectietest te ontwikkelen die de infectiviteit van het virus kan informeren. We voorzien dat aptamer specifiek voor verschillende varianten of stereotypen van het virus kan worden verkregen, waardoor het mogelijk wordt om varianten die de grootste bedreiging voor de samenleving vormen snel te monitoren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Het visualiseren van Eiwitten en macromoleculaire complexen door Negative Stain EM: van Grid Voorbereiding op Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Benutting van microschaal Silicon Cantilevers to Cellular contractiele functie Beoordelen<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Contactlenzen Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...