Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
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Nous tenons à remercier Mme Laura M. Cooper et le Dr Lijun Rong de l’Université de l’Illinois à Chicago pour avoir fourni les échantillons de pseudovirus utilisés dans ce protocole (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), ainsi que le Dr Alvaro Hernandez et le Dr Chris Wright du Centre de biotechnologie Roy J. Carver de l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign pour leur aide au séquençage à haut débit, et de nombreux membres du groupe Lu qui nous ont aidés avec des techniques de sélection in vitro et de caractérisation des aptamères. Ce travail a été soutenu par une subvention RAPID de la National Science Foundation (CBET 20-29215) et une subvention de démarrage de l’Institute for Sustainability, Energy, and Environment de l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign et de l’Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. remercie le PEW Latin American Fellowship pour son soutien financier. Nous remercions également la Fondation Robert A. Welch (subvention F-0020) pour son soutien au programme de recherche du groupe Lu à l’Université du Texas à Austin.

1. Préparation des réactifs et des tampons
<ol><li>Préparer 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) en ajoutant 0,9 M Tris-base, 0,9 M d’acide borique, 20 mM EDTA (sel disodique) et eau désionisée jusqu’à un volume final de 1 L. Mélanger jusqu’à ce que tous les composants soient dissous.</li>
	<li>Préparer une solution mère de polyacrylamide dénaturant à 10% comme suit. Dans une bouteille en verre de 250 mL, ajouter 120 g d’urée (8 M), 25 mL de 10x TBE, 62,5 mL de solution d’acrylamide/bi...

SELEX permet non seulement l’identification d’aptamères à haute affinité, dans la gamme pM-nM 22,43,44,45, mais aussi avec une sélectivité élevée et accordable. En tirant parti de la contre-sélection, il est possible d’obtenir des aptamères présentant une sélectivité difficile. Par exemple, le groupe Li a démontré sa capacité à obtenir des séquences capables de différen...

Les infections virales ont d’énormes répercussions économiques et sociétales dans le monde entier, comme l’a montré de plus en plus la récente pandémie de COVID-19. Un diagnostic rapide et précis est primordial dans le traitement des infections virales tout en prévenant la propagation des virus aux personnes en bonne santé. Bien que de nombreuses méthodes de détection de virus aient été développées, telles que les tests PCR1,2 et les tests inmunoassays3, la plupart des méthodes actuellement utilisées ne sont pas en mesure de déterminer si le virus détecté est réellement infectieux ou non. En effet, la présence de composants du virus seuls, tels que l’acide nucléique viral ou les protéines, n’indique pas que le virus infectieux intact est présent, et les niveaux de ces biomarqueurs ont montré une faible corrélation avec l’infectiosité 4,5,6. Par exemple, l’ARN viral, couramment utilisé pour les tests actuels de dépistage de la COVID-19 basés sur la PCR, présente des niveaux très faibles dans les premiers stades de l’infection lorsque le patient est contagieux, tandis que le taux d’ARN est souvent encore très élevé lorsque les patients se sont rétablis de l’infection et ne sont plus contagieux 7,8. Les biomarqueurs de protéines virales ou d’antigènes suivent une tendance similaire, mais apparaissent généralement encore plus tard que l’ARN viral et sont donc encore moins prédictifs de l’infectabilité 6,9. Pour remédier à cette limitation, certaines méthodes permettant d’informer sur l’état d’infectiosité du virus ont été développées, mais sont basées sur des techniques de microbiologie de culture cellulaire qui nécessitent beaucoup de temps (jours ou semaines) pour obtenir des résultats 4,10. Ainsi, le développement de nouveaux capteurs capables d’informer sur l’infectabilité des échantillons cliniques ou environnementaux peut éviter les retards dans le traitement et la propagation du virus. Cependant, très peu de méthodes peuvent obtenir des molécules de détection capables de reconnaître un virion infectieux intact et de le différencier du même virus qui a été rendu non infectieux.
Dans ce contexte, les aptamères sont particulièrement bien adaptés en tant qu’outil biomoléculaire unique11,12,13,14. Les aptamères sont de courtes molécules d’ADN ou d’ARN simple brin avec une séquence nucléotidique spécifique qui leur permet de former une conformation 3D spécifique pour reconnaître une cible à haute affinité et sélectivité15,16. Ils sont obtenus par un processus de sélection combinatoire appelé évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX), également connu sous le nom de sélection in vitro, qui est réalisé dans des tubes à essai avec une grande bibliothèque aléatoire d’échantillonnage d’ADN de 10 14-10 15 séquences17,18,19. À chaque cycle de ce processus itératif, le pool d’ADN est d’abord soumis à une pression de sélection par incubation avec la cible dans les conditions souhaitées. Toutes les séquences qui ne sont pas liées à la cible sont ensuite supprimées, ne laissant derrière elles que les quelques séquences capables de se lier dans les conditions données. Enfin, les séquences qui ont été sélectionnées à l’étape précédente sont amplifiées par PCR, enrichissant la population du pool avec les séquences fonctionnelles souhaitées pour le prochain tour de sélection, et le processus est répété. Lorsque l’activité du pool de sélection atteint un plateau (généralement après 8-15 tours), la bibliothèque est analysée par séquençage de l’ADN pour identifier les séquences gagnantes présentant la plus grande affinité.
SELEX présente des avantages uniques qui peuvent être exploités pour obtenir une sélectivité accrue par rapport à d’autres cibles similaires20,21, telles que l’état d’infectiosité du virus 22. Tout d’abord, une grande variété de différents types de cibles peuvent être utilisées pour la sélection, des petites molécules et protéines aux agents pathogènes entiers et aux cellules16. Ainsi, pour obtenir un aptamère qui se lie à un virus infectieux, un virus intact peut être utilisé comme cible, au lieu d’une protéine de surface virale19. Le virus entier SELEX permet de sélectionner des aptamères qui se lient spécifiquement à l’état natif du virus, sans qu’il soit nécessaire de perturber le virus. Deuxièmement, SELEX peut être conçu sur mesure pour éliminer les cibles concurrentes 21,23, telles que d’autres virus similaires ou des virus inactivés non infectieux, en utilisant des étapes de contre-sélection à chaque tour de sélection22. Au cours des étapes de contre-sélection, le pool d’ADN est exposé à des cibles pour lesquelles la liaison n’est pas souhaitée, et toutes les séquences qui se lient sont rejetées.
Dans ce travail, nous fournissons un protocole qui peut généralement être appliqué pour sélectionner des aptamères qui se lient à un virus infectieux, mais pas au même virus qui a été rendu non infectieux par une méthode de désinfection particulière ou à un autre virus apparenté. Cette méthode permet d’obtenir des agents de reconnaissance en fonction des différences fonctionnelles de la surface du virus, qui n’ont pas besoin d’être connues à l’avance, et offre ainsi un avantage supplémentaire pour la détection d’agents pathogènes nouvellement apparus ou de maladies peu étudiées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

Les infections virales ont un impact majeur sur la société; La plupart des méthodes de détection ont des difficultés à déterminer si un virus détecté est infectieux, ce qui entraîne des retards dans le traitement et une propagation ultérieure du virus. Le développement de nouveaux capteurs capables d’informer sur l’infectabilité d’échantillons cliniques ou environnementaux permettra de relever ce défi non relevé. Cependant, très peu de méthodes peuvent obtenir des molécules de détection capables de reconnaître un virus infectieux intact et de le différencier du même virus qui a été rendu non infectieux par les méthodes de désinfection. Ici, nous décrivons un protocole pour sélectionner des aptamères capables de distinguer les virus infectieux des virus non infectieux en utilisant l’évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX). Nous profitons de deux fonctionnalités de SELEX. Tout d’abord, SELEX peut être conçu sur mesure pour éliminer les cibles concurrentes, telles que les virus non infectieux ou d’autres virus similaires, en utilisant la contre-sélection. De plus, le virus entier peut être utilisé comme cible pour SELEX, au lieu d’une protéine de surface virale, par exemple. Le virus entier SELEX permet de sélectionner des aptamères qui se lient spécifiquement à l’état natif du virus, sans avoir besoin de perturber le virus. Cette méthode permet ainsi d’obtenir des agents de reconnaissance en fonction des différences fonctionnelles de surface des agents pathogènes, qui n’ont pas besoin d’être connues à l’avance.

Étant donné que les aptamères d’ADN peuvent être obtenus à l’aide de SELEX dans un tube à essai15, cette stratégie SELEX a été soigneusement conçue pour inclure à la fois des étapes de sélection positive vers le virus infectieux intact et entier (c.-à-d. conserver les molécules d’ADN qui se lient au virus infectieux), ainsi que des étapes de contre-sélection pour le même virus qui a été rendu non infectieux par une méthode de désinfection particulière. en particulier ...

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In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Nous fournissons un protocole qui peut généralement être appliqué à certains aptamères qui se lient uniquement aux virus infectieux et non aux virus qui ont été rendus non infectieux par une méthode de désinfection ou à tout autre virus similaire. Cela ouvre la possibilité de déterminer le statut d’infectiosité dans les tests portables et rapides.

Sélection in vitro d’aptamères pour différencier les virus infectieux des virus non infectieux

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Ce protocole décrit comment sélectionner des aptamères d’ADN capables de distinguer les virus infectieux des virus non infectieux afin d’obtenir une molécule de détection capable d’informer l’infectabilité des échantillons cliniques ou environnementaux. Cette technique peut être appliquée pour obtenir des aptamères sélectifs pour de nombreux autres virus, y compris les virus émergents, car elle ne nécessite pas de connaissance préalable des structures ou des séquences du virus. Cette technique permet le développement de capteurs aptamères pour le diagnostic clinique et la surveillance environnementale des virus infectieux afin de détecter si une personne est contagieuse ou si une méthode de désinfection environnementale fonctionne comme prévu.La sélection peut être un processus difficile, surtout pour ceux qui sont nouveaux dans ce domaine. Il est important d’optimiser les conditions de PCR et de suivre l’avancement de la sélection avec la qPCR. Marcos Gramajo, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer, concevez la bibliothèque initiale d’ADN simple brin ou SS et les amorces. Obtenez les oligos d’ADN à partir de sources commerciales avec purification de dessalage standard. Purifier la bibliothèque d’ADN SS et les amorces sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant à 10% suivie d’une précipitation à l’éthanol.Ensuite, procurez-vous une solution mère de virus infectieux et non infectieux ou préparez-les comme décrit dans le manuscrit textuel. Pour la dénaturation de la bibliothèque d’ADN SS, mélanger 10 microlitres de 100 micromolaires de la bibliothèque d’ADN SS avec 240 microlitres de tampon SELEX. Chauffer le mélange à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bain sec, puis placer le tube sur de la glace pendant 15 minutes.Mélanger 250 microlitres de bibliothèque d’ADN SS dans un tampon SELEX avec 50 microlitres de virus infectieux pour une sélection positive. Incuber pendant deux heures à température ambiante. Ajoutez ensuite 400 microlitres d’une séquence millimolaire T20 à un filtre de 0,5 millilitre pour bloquer les sites non spécifiques.Incuber les filtres pendant 30 minutes. Centrifuger le filtre à 14 000 G pendant 10 minutes pour éliminer la solution T20. Lavez ensuite le filtre trois fois avec le tampon SELEX pour éliminer les séquences T20 en excès.Ensuite, ajoutez le mélange de virus infectieux de la bibliothèque d’ADN SS au filtre bloqué de 100 kilodaltons et à la centrifugeuse pour laver les séquences non liées. Lavez le filtre trois fois en ajoutant 400 microlitres de tampon SELEX et de centrifugation. Conservez la fraction dans le filtre et jetez l’écoulement.Pour éluer les séquences liées, changez le tube de collecte du filtre centrifugeuse et ajoutez 300 microlitres de tampon SELEX contenant huit molaires d’urée au filtre. Chauffer le filtre à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis centrifuger pour recueillir le flux continu contenant les séquences éluées. Une fois cela fait, lavez les matériaux avec 10% d’eau de Javel.Ensuite, ajoutez la solution de virus infectieux à ADN SS recueillie à l’étape précédente dans un filtre bloqué de 10 kilodaltons, centrifugez à 14 000 G pendant 15 minutes et jetez le flux. Laver le filtre trois fois avec 300 microlitres de tampon SELEX pour éliminer l’urée par centrifugation et éliminer l’écoulement. Récupérez la solution dans le filtre en la retournant dans un tube de collecte propre et en centrifugeant pendant cinq minutes.Mesurer le volume final de la solution récupérée à l’aide d’une pipette et l’étiqueter comme un échantillon de la ronde 1A. Prenez 90% de l’échantillon de la ronde 1A comme modèle lors du premier tour et exécutez la PCR en utilisant des conditions optimisées. Pour récupérer l’ADN SS à l’aide de billes magnétiques modifiées par la streptavidine ou MB, divisez le produit en aliquotes de 50 microlitres et ajoutez-les à des tubes microcentrifugés contenant 50 microlitres MB. Incuber le tube pendant 30 minutes avec une légère agitation à température ambiante.Placez ensuite le tube sur la grille magnétique pour isoler le MB et retirer le surnageant par pipetage. Lavez le MB deux fois en ajoutant 200 microlitres de tampon de liaison et de lavage au tube. Retirez ensuite le tube de la grille magnétique et tapotez-le avant de remettre en suspension le MB à une solution homogène par pipetage.Replacez le tube sur la grille magnétique et retirez le surnageant. Après le deuxième lavage, remettre le MB en suspension dans 100 microlitres de tampon SELEX et chauffer la solution à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Placez immédiatement le tube dans le rack magnétique et récupérez le surnageant contenant le pool d’ADN SS.Répétez cette étape de récupération en ajoutant 50 microlitres de tampon SELEX. Mesurez le volume final de la fraction récupérée et étiquetez-le comme rond 1X. Pour la dénaturation du pool d’ADN SS, prélevez 60% de l’échantillon Round 1X et mélangez-le avec 50 microlitres de tampon SELEX.Chauffer l’échantillon dans un bain sec, puis placer le tube sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, mélangez le pool d’ADN SS dénaturé dans un tampon SELEX avec 50 microlitres de chaque virus comme étape de contre-sélection et incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir bloqué les sites non spécifiques dans les filtres à centrifugation, ajouter le mélange dénaturé de pool d’ADN SS incubé avec une solution virale à un filtre bloqué de 100 kilodaltons.Centrifuger le filtre à 14 000 g pendant 10 minutes et recueillir le débit. Prenez 300 microlitres de fraction et mélangez-les avec 50 microlitres de virus infectieux contenant 100 millions de copies par millilitre. Incuber pendant deux heures à température ambiante.Préparer un mélange maître qPCR standard et des dilutions de la bibliothèque d’ADN SS purifié comme décrit dans le texte. Exécutez la qPCR pour déterminer le cycle de seuil. Après l’exécution, utilisez une courbe standard pour quantifier la quantité d’ADN SS dans les rondes 1A et 1X.Ensuite, calculez le rendement d’élution comme la quantité d’ADN liée divisée par la quantité initiale d’ADN et tracez le rendement d’élution par rapport au nombre rond. Enfin, tracez les courbes de fusion pour différents tours. Pour un séquençage à haut débit, sélectionnez un kit approprié disponible dans le commerce.Préparez plusieurs pools de cycles de sélection représentant un enrichissement élevé, moyen et faible, ainsi que le pool final à l’aide d’une paire d’index différente dans les adaptateurs de chaque pool. Envoyez ensuite la bibliothèque finale préparée à l’installation de séquençage. Pour l’analyse de séquençage, les séquences ont été démultiplexées par l’installation de séquençage.Supprimez les adaptateurs de séquençage et les amorces de sélection à l’aide du programme de ligne de commande Cutadapt. Utilisez ensuite le programme FASTX-Toolkit pour supprimer les séquences de faible qualité. Fusionnez ensuite les fichiers de séquence dans le sens inverse avec ceux dans le sens avant à l’aide de la fonction FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ complément sur les fichiers de sens inverse.Utilisez ensuite le programme de TAO intégré pour fusionner les fichiers en un seul fichier. Utilisez la boîte à outils d’analyse FASTAptamer pour analyser l’enrichissement des séquences dans différents pools de sélection. Tout d’abord, utilisez les fonctions de cluster FASTAptamer count et FASTAptamer pour regrouper des séquences similaires en clusters.Ensuite, utilisez la fonction d’enrichissement FASTAptamer pour obtenir des informations sur l’enrichissement des séquences et des clusters. Identifier les séquences aptamères candidates à partir des informations d’enrichissement obtenues par analyse de séquence. Sélectionnez plusieurs séquences d’aptamères et effectuez un dépistage initial à l’aide d’un test de liaison.Dans cette analyse, la qPCR a été utilisée pour surveiller la progression de SELEX des aptamères infectieux spécifiques du SARS-CoV-2. Le rendement d’élution a d’abord augmenté à chaque cycle de SELEX et s’est stabilisé aux huitième et neuvième tours. En comparant les courbes de fusion, on a observé un décalage du pic à une température de fusion élevée de 77 à 79 degrés Celsius.De plus, lors des deux derniers tours, un pic à basse température de fusion a été observé. L’abondance relative en lectures par million pour le SARS2 AR10 séquencé obtenu au cours de cycles de sélection consécutifs est montrée. La structure prédite du SARS2 AR10 a montré une structure secondaire structurée contenant une région de boucle souche qui pourrait être impliquée dans la reconnaissance du virus.Une fois les aptamères obtenus, ils peuvent être incorporés dans des optiques électriques, un autre type de capteurs, pour développer un test de détection de virus portail et rapide qui peut informer l’infectiosité du virus. Nous envisageons que des aptamères spécifiques à différentes variantes ou stéréotypes du virus puissent être obtenus, ce qui permet une surveillance rapide des variantes qui constituent la plus grande menace pour la société.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisation protéines et de complexes macromoléculaires par EM négatif Tache: de la préparation de grille pour l&#39;acquisition d&#39;images

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

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