Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
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Wir danken Frau Laura M. Cooper und Dr. Lijun Rong von der University of Illinois in Chicago für die Bereitstellung der in diesem Protokoll verwendeten Pseudovirusproben (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1) sowie Dr. Alvaro Hernandez und Dr. Chris Wright von der DNA Services Facility des Roy J. Carver Biotechnology Center an der University of Illinois at Urbana-Champaign für ihre Unterstützung bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung. und viele Mitglieder der Lu-Gruppe, die uns bei der In-vitro-Selektion und Aptamer-Charakterisierungstechniken geholfen haben. Diese Arbeit wurde durch einen RAPID-Zuschuss der National Science Foundation (CBET 20-29215) und einen Seed-Zuschuss des Institute for Sustainability, Energy, and Environment an der University of Illinois at Urbana-Champaign und des Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965) unterstützt. A.S.P. dankt dem PEW Latin American Fellowship für die finanzielle Unterstützung. Wir danken auch der Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) für die Unterstützung des Forschungsprogramms der Lu-Gruppe an der University of Texas in Austin.

1. Herstellung von Reagenzien und Puffern
<ol><li>Bereiten Sie 10x Trisborat-EDTA (10x TBE) zu, indem Sie 0,9 M Tris-Base, 0,9 M Borsäure, 20 mM EDTA (Dinatriumsalz) und deionisiertes Wasser zu einem Endvolumen von 1 l hinzufügen. Mischen, bis sich alle Komponenten aufgelöst haben.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10%ige denaturierende Polyacrylamid-Stammlösung wie folgt vor. In eine 250-ml-Glasflasche werden 120 g Harnstoff (8 m), 25 ml 10-facher FSME, 62,5 ml 40%ige Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (29:...

SELEX ermöglicht nicht nur die Identifizierung von Aptameren mit hoher Affinität, im pM-nM-Bereich 22,43,44,45, sondern auch mit hoher und abstimmbarer Selektivität. Durch die Ausnutzung der Counter-Selektion können Aptamere mit anspruchsvoller Selektivität erhalten werden. So hat die Li-Gruppe beispielsweise gezeigt, dass sie in der Lage ist, Sequenzen zu erhalten, mit denen pathogene Ba...

Virusinfektionen haben weltweit enorme wirtschaftliche und gesellschaftliche Auswirkungen, wie die jüngste COVID-19-Pandemie immer deutlicher wurde. Eine rechtzeitige und genaue Diagnose ist von größter Bedeutung, um Virusinfektionen zu behandeln und gleichzeitig die Ausbreitung von Viren auf gesunde Menschen zu verhindern. Obwohl viele Virusnachweismethoden entwickelt wurden, wie z. B. PCR-Tests1,2 und Inmunoassays3, sind die meisten der derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, festzustellen, ob das nachgewiesene Virus tatsächlich infektiös ist oder nicht. Dies liegt daran, dass das Vorhandensein von Bestandteilen des Virus allein, wie z. B. virale Nukleinsäure oder Proteine, nicht darauf hinweist, dass das intakte, infektiöse Virus vorhanden ist, und die Konzentrationen dieser Biomarker eine schlechte Korrelation mit der Infektiosität gezeigt haben 4,5,6. So weist beispielsweise die virale RNA, die üblicherweise für die aktuellen PCR-basierten COVID-19-Tests verwendet wird, in den frühen Stadien der Infektion sehr niedrige Werte auf, wenn der Patient ansteckend ist, während der RNA-Spiegel oft noch sehr hoch ist, wenn sich die Patienten von der Infektion erholt haben und nicht mehr ansteckend sind 7,8. Die viralen Protein- oder Antigen-Biomarker folgen einem ähnlichen Trend, treten aber in der Regel noch später als die virale RNA auf und sind daher noch weniger prädiktiv für die Infektiosität 6,9. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, wurden einige Methoden entwickelt, die Aufschluss über den Infektiositätsstatus des Virus geben können, aber auf mikrobiologischen Techniken der Zellkultur basieren, die eine lange Zeit (Tage oder Wochen) benötigen, um Ergebnisse zu erhalten 4,10. So kann die Entwicklung neuer Sensoren, die Aufschluss über die Infektierbarkeit von klinischen oder Umweltproben geben können, Verzögerungen bei der Behandlung und eine weitere Ausbreitung des Virus vermeiden. Es gibt jedoch nur sehr wenige Methoden, die Sensormoleküle erhalten, die ein intaktes infektiöses Virion erkennen und es von demselben Virus unterscheiden können, das nicht infektiös geworden ist.
In diesem Zusammenhang eignen sich Aptamere besonders gut als einzigartiges biomolekulares Werkzeug 11,12,13,14. Aptamere sind kurze, einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, die es ihnen ermöglicht, eine spezifische 3D-Konformation zu bilden, um ein Ziel mit hoher Affinität und Selektivität zu erkennen15,16. Sie werden durch einen kombinatorischen Selektionsprozess erhalten, der als systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) bezeichnet wird, auch bekannt als In-vitro-Selektion, der in Reagenzgläsern mit einer großen zufälligen DNA-Probenbibliothek von 10 14-10 15 Sequenzen durchgeführt wird17,18,19. In jeder Runde dieses iterativen Prozesses wird der DNA-Pool zunächst durch Inkubation mit dem Target unter den gewünschten Bedingungen einem Selektionsdruck ausgesetzt. Alle Sequenzen, die nicht an das Ziel gebunden sind, werden dann entfernt, so dass nur die wenigen Sequenzen übrig bleiben, die unter den gegebenen Bedingungen binden können. Schließlich werden die im vorherigen Schritt ausgewählten Sequenzen durch PCR amplifiziert, wodurch die Population des Pools mit den gewünschten funktionellen Sequenzen für die nächste Selektionsrunde angereichert wird, und der Vorgang wird wiederholt. Wenn die Aktivität des Selektionspools ein Plateau erreicht (in der Regel nach 8-15 Runden), wird die Bibliothek durch DNA-Sequenzierung analysiert, um die Gewinnsequenzen mit der höchsten Affinität zu identifizieren.
SELEX hat einzigartige Vorteile, die genutzt werden können, um eine erhöhte Selektivität gegen andere ähnliche Zielmoleküle 20,21 zu erreichen, z. B. für den Infektiositätsstatus des Virus22. Erstens kann eine Vielzahl unterschiedlicher Arten von Targets für die Selektion verwendet werden, von kleinen Molekülen und Proteinen bis hin zu ganzen Krankheitserregern und Zellen16. Um ein Aptamer zu erhalten, das an ein infektiöses Virus bindet, kann daher ein intaktes Virus anstelle eines viralen Oberflächenproteins als Ziel verwendet werden19. SELEX ermöglicht die Auswahl von Aptameren, die spezifisch an den nativen Zustand des Virus binden, ohne dass das Virus gestört werden muss. Zweitens kann SELEX so maßgeschneidert werden, dass konkurrierende Zielmoleküle 21,23, wie z. B. andere ähnliche Viren oder nicht-infektiöse inaktivierte Viren, unter Verwendung von Gegenauswahlschritten in jeder Auswahlrunde22 entfernt werden. Während der Zählerauswahlschritte wird der DNA-Pool Zielen ausgesetzt, für die eine Bindung nicht erwünscht ist, und alle Sequenzen, die binden, werden verworfen.
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das allgemein für die Auswahl von Aptameren verwendet werden kann, die an ein infektiöses Virus binden, aber nicht an dasselbe Virus, das durch eine bestimmte Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurde, oder an andere verwandte Viren. Diese Methode ermöglicht es, Erkennungsmittel auf der Grundlage funktioneller Unterschiede der Virusoberfläche zu erhalten, die nicht im Voraus bekannt sein müssen, und bietet so einen zusätzlichen Vorteil für den Nachweis neu aufgetretener Erreger oder für wenig erforschte Krankheiten.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

Virusinfektionen haben große Auswirkungen auf die Gesellschaft; Die meisten Nachweismethoden haben Schwierigkeiten bei der Feststellung, ob ein nachgewiesenes Virus infektiös ist, was zu Verzögerungen bei der Behandlung und einer weiteren Ausbreitung des Virus führt. Die Entwicklung neuer Sensoren, die Aufschluss über die Infektierbarkeit von klinischen oder Umweltproben geben können, wird diese ungelöste Herausforderung meistern. Es gibt jedoch nur sehr wenige Methoden, die Sensormoleküle erhalten, die ein intaktes infektiöses Virus erkennen und es von demselben Virus unterscheiden können, das durch Desinfektionsmethoden nicht infektiös gemacht wurde. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Auswahl von Aptameren, das infektiöse Viren von nicht-infektiösen Viren unterscheiden kann, indem wir systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) verwenden. Wir machen uns zwei Funktionen von SELEX zunutze. Erstens kann SELEX maßgeschneidert werden, um konkurrierende Ziele, wie z. B. nicht-infektiöse Viren oder andere ähnliche Viren, durch Counter-Selektion zu entfernen. Darüber hinaus kann das gesamte Virus als Ziel für SELEX verwendet werden, anstatt beispielsweise ein virales Oberflächenprotein. SELEX ermöglicht die Auswahl von Aptameren, die spezifisch an den nativen Zustand des Virus binden, ohne dass das Virus gestört werden muss. Diese Methode ermöglicht es somit, Erkennungsmittel auf der Grundlage funktioneller Unterschiede in der Oberfläche von Krankheitserregern zu erhalten, die nicht im Voraus bekannt sein müssen.

Da DNA-Aptamere unter Verwendung von SELEX in einem Reagenzglas15 gewonnen werden können, wurde diese SELEX-Strategie sorgfältig entwickelt, um sowohl positive Selektionsschritte in Richtung des intakten, vollständigen infektiösen Virus (d. h. die Beibehaltung der DNA-Moleküle, die an das infektiöse Virus binden) als auch Gegenauswahlschritte für dasselbe Virus zu umfassen, das durch eine bestimmte Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurde. insbesondere UV-Behandlung, indem die D...

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In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, das im Allgemeinen auf die Auswahl von Aptameren angewendet werden kann, die nur an infektiöse Viren binden und nicht an Viren, die durch eine Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurden, oder an andere ähnliche Viren. Dies eröffnet die Möglichkeit, den Infektiositätsstatus in tragbaren und Schnelltests zu bestimmen.

In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie DNA-Aptamere ausgewählt werden, die infektiöse Viren von nicht-infektiösen Viren unterscheiden können, um Sensormoleküle zu erhalten, die in der Lage sind, die Infektiosität von klinischen oder Umweltproben zu bestimmen. Diese Technik kann angewendet werden, um selektive Aptamere für viele andere Viren, einschließlich neu auftretender Viren, zu erhalten, da sie keine Vorkenntnisse über die Strukturen oder Sequenzen des Virus erfordert. Diese Technik ermöglicht die Entwicklung von Aptamer-Sensoren für die klinische Diagnostik und Umweltüberwachung infektiöser Viren, um zu erkennen, ob jemand ansteckend ist oder ob eine Umgebungsdesinfektionsmethode wie vorgesehen funktioniert.Die Auswahl kann ein schwieriger Prozess sein, insbesondere für diejenigen, die neu darin sind. Es ist wichtig, die PCR-Bedingungen zu optimieren und den Fortschritt der Selektion mit qPCR zu überwachen. Das Verfahren wird Marcos Gramajo, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren.Entwerfen Sie zunächst die anfängliche einzelsträngige oder SS-DNA-Bibliothek und die Primer. Beziehen Sie die DNA-Oligos aus kommerziellen Quellen mit Standard-Entsalzungsreinigung. Reinigen Sie die SS-DNA-Bibliothek und die Primer mit einer 10%igen denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließender Ethanolfällung.Als nächstes besorgen Sie sich eine Stammlösung aus infektiösen und nicht-infektiösen Viren oder bereiten Sie sie wie im Textmanuskript beschrieben zu. Zur Denaturierung der SS-DNA-Bibliothek mischen Sie 10 Mikroliter der 100-Mikromolaren SS-DNA-Bibliothek mit 240 Mikrolitern SELEX-Puffer. Erhitzen Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in einem Trockenbad und stellen Sie das Röhrchen dann für 15 Minuten auf Eis.Mischen Sie 250 Mikroliter der SS-DNA-Bibliothek im SELEX-Puffer mit 50 Mikrolitern infektiösem Virus für eine positive Selektion. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie dann 400 Mikroliter einer millimolaren T20-Sequenz in einen 0,5-Milliliter-Filter, um die unspezifischen Stellen zu blockieren.Inkubieren Sie die Filter 30 Minuten lang. Zentrifugieren Sie den Filter 10 Minuten lang bei 14.000 G, um die T20-Lösung zu entfernen. Waschen Sie den Filter anschließend dreimal mit SELEX-Puffer, um überschüssige T20-Sequenzen zu entfernen.Als nächstes geben Sie die infektiöse Virusmischung der SS-DNA-Bibliothek in den verstopften 100-Kilodalton-Filter und die Zentrifuge, um ungebundene Sequenzen zu waschen. Waschen Sie den Filter dreimal, indem Sie 400 Mikroliter SELEX-Puffer hinzufügen und zentrifugieren. Lassen Sie die Fraktion im Filter und verwerfen Sie den Durchfluss.Um gebundene Sequenzen zu eluieren, wechseln Sie das Auffangröhrchen des Zentrifugenfilters und geben Sie 300 Mikroliter SELEX-Puffer mit acht molaren Harnstoff in den Filter. Erhitzen Sie den Filter 15 Minuten lang auf 95 Grad Celsius und zentrifugieren Sie dann, um den Durchfluss mit den eluierten Sequenzen aufzufangen. Wenn Sie fertig sind, waschen Sie die Materialien mit 10%Bleichmittel.Als nächstes wird die im vorherigen Schritt gesammelte infektiöse SS-DNA-Viruslösung in einen verstopften 10-Kilodalton-Filter gegeben, 15 Minuten lang bei 14.000 G zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Waschen Sie den Filter dreimal mit 300 Mikrolitern SELEX-Puffer, um den Harnstoff durch Zentrifugation zu entfernen, und verwerfen Sie den Durchfluss. Gewinnen Sie die Lösung im Filter zurück, indem Sie sie in einem sauberen Auffangröhrchen auf den Kopf stellen und fünf Minuten lang zentrifugieren.Messen Sie das endgültige Volumen der gewonnenen Lösung mit einer Pipette und kennzeichnen Sie sie als Runde 1A-Probe. Nehmen Sie in der ersten Runde 90 % der Probe der Runde 1A als Vorlage und führen Sie die PCR unter optimierten Bedingungen durch. Um SS-DNA mit Streptavidin-modifizierten magnetischen Beads oder MB zu gewinnen, teilen Sie das Produkt in 50-Mikroliter-Aliquots auf und geben Sie diese in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern MB. Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur.Legen Sie dann das Röhrchen auf das magnetische Gestell, um den MB zu isolieren, und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Waschen Sie den MB zweimal, indem Sie 200 Mikroliter Binde- und Waschpuffer in die Tube geben. Nehmen Sie dann das Röhrchen aus dem Magnetgestell und klopfen Sie darauf, bevor Sie das MB durch Pipettieren wieder in eine homogene Lösung bringen.Legen Sie das Röhrchen wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand. Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie den MB in 100 Mikroliter SELEX-Puffer und erhitzen Sie die Lösung 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Legen Sie das Röhrchen sofort in das Magnetgestell und sammeln Sie den Überstand mit dem SS-DNA-Pool auf.Wiederholen Sie diesen Wiederherstellungsschritt und fügen Sie 50 Mikroliter SELEX-Puffer hinzu. Messen Sie das Endvolumen der zurückgewonnenen Fraktion und bezeichnen Sie es als Runde 1X. Zur Denaturierung des SS-DNA-Pools werden 60 % der Round 1X-Probe entnommen und mit 50 Mikrolitern SELEX-Puffer vermischt.Erhitzen Sie die Probe in einem Trockenbad und legen Sie das Röhrchen dann 15 Minuten lang auf Eis. Als nächstes wird der denaturierte SS-DNA-Pool in SELEX-Puffer mit 50 Mikrolitern jedes Virus als Gegenselektionsschritt gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Blockieren der unspezifischen Stellen in Zentrifugenfiltern wird der mit einer Viruslösung inkubierte denaturierte SS-DNA-Pool in einen verstopften 100-Kilodalton-Filter gegeben.Zentrifugieren Sie den Filter bei 14.000 G für 10 Minuten und fangen Sie den Durchfluss auf. Nehmen Sie 300 Mikroliter Fraktion und mischen Sie sie mit 50 Mikrolitern infektiösem Virus, das 100 Millionen Kopien pro Milliliter enthält. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.Bereiten Sie einen Standard-qPCR-Mastermix und Verdünnungen der gereinigten SS-DNA-Bibliothek vor, wie im Text beschrieben. Führen Sie die qPCR aus, um den Schwellenwertzyklus zu bestimmen. Verwenden Sie nach dem Lauf eine Standardkurve, um die Menge an SS-DNA in Runde 1A und Runde 1X zu quantifizieren.Berechnen Sie dann die Elutionsausbeute als gebundene DNA-Menge geteilt durch die ursprüngliche DNA-Menge und tragen Sie die Elutionsausbeute über die runde Zahl auf. Zum Schluss zeichnen Sie die Schmelzkurven für verschiedene Runden. Wählen Sie für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz ein geeignetes, kommerziell erhältliches Kit aus.Bereiten Sie mehrere Pools von Auswahlrunden vor, die eine hohe, mittlere und niedrige Anreicherung darstellen, sowie den endgültigen Pool mit einem anderen Indexpaar in den Adaptern für jeden Pool. Senden Sie dann die vorbereitete endgültige Bibliothek an die Sequenzierungseinrichtung. Für die Sequenzierungsanalyse wurden die Sequenzen von der Sequenzieranlage demultiplext.Entfernen Sie die Sequenzadapter und Selektionsprimer mit dem Kommandozeilenprogramm Cutadapt. Verwenden Sie dann das FASTX-Toolkit-Programm, um Sequenzen mit geringer Qualität zu entfernen. Führen Sie dann die Sequenzdateien in umgekehrter Richtung mit denen in Vorwärtsrichtung zusammen, indem Sie das FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ Komplementfunktion für die Dateien in umgekehrter Richtung verwenden.Verwenden Sie dann das integrierte CAT-Programm, um die Dateien zu einer einzigen Datei zusammenzuführen. Verwenden Sie das Analyse-Toolkit FASTAptamer, um die Anreicherung von Sequenzen über verschiedene Auswahlpools hinweg zu analysieren. Erstens, um die Clusterfunktionen FASTAptamer count und FASTAptamer zu verwenden, um ähnliche Sequenzen in Clustern zu gruppieren.Verwenden Sie als Nächstes die Anreicherungsfunktion FASTAptamer, um Informationen zur Anreicherung von Sequenzen und Clustern abzurufen. Identifizieren Sie die Kandidaten-Aptamer-Sequenzen anhand der durch die Sequenzanalyse erhaltenen Anreicherungsinformationen. Wählen Sie mehrere Aptamersequenzen aus und führen Sie ein erstes Screening mit einem Bindungsassay durch.In dieser Analyse wurde die qPCR verwendet, um den Verlauf von SELEX von infektiösen SARS-CoV-2-spezifischen Aptameren zu überwachen. Die Elutionsausbeute stieg zunächst mit jeder Runde von SELEX und pendelte sich in den Runden acht und neun ein. Durch den Vergleich der Schmelzkurven wurde eine Verschiebung vom Peak bei hoher Schmelztemperatur von 77 auf 79 Grad Celsius beobachtet.Darüber hinaus wurde in den letzten beiden Runden ein Peak bei niedriger Schmelztemperatur beobachtet. Die relative Häufigkeit in Reads per Million für das sequenzierte SARS2 AR10, das über aufeinanderfolgende Auswahlrunden erhalten wurde, wird gezeigt. Die vorhergesagte Struktur von SARS2 AR10 zeigte eine strukturierte Sekundärstruktur, die eine Stammschleifenregion enthielt, die an der Erkennung des Virus beteiligt sein könnte.Sobald Aptamere gewonnen wurden, können sie in elektrische Optiken, eine andere Art von Sensoren, eingebaut werden, um Portal- und Schnelltests zum Virusnachweis zu entwickeln, die die Infektiosität des Virus bestimmen können. Wir stellen uns vor, dass Aptamer, die für verschiedene Virusvarianten oder Stereotypen spezifisch sind, gewonnen werden können, was eine schnelle Überwachung von Varianten ermöglicht, die die größte Bedrohung für die Gesellschaft darstellen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

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Forschung

Biotechnik

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The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

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Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

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Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

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Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Kontaktlinsen zu Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

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