Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

ברצוננו להודות לגב' לורה מ. קופר וד"ר ליג'ון רונג מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו על אספקת דגימות הפסאודו-וירוס המשמשות בפרוטוקול זה (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), כמו גם לד"ר אלווארו הרננדז וד"ר כריס רייט ממתקן שירותי הדנ"א של מרכז רוי ג'יי קארבר לביוטכנולוגיה באוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין על עזרתם בריצוף בתפוקה גבוהה, וחברים רבים בקבוצת Lu שעזרו לנו בטכניקות בחירה חוץ גופית ואפיון אפטמר. עבודה זו נתמכה על ידי מענק RAPID מהקרן הלאומית למדע (CBET 20-29215) ומענק זרע מהמכון לקיימות, אנרגיה וסביבה באוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין ומכון אילינוי-JITRI (JITRI 23965). א.ס.פ. מודה למלגת פיו באמריקה הלטינית על התמיכה הכספית. אנו מודים גם לקרן רוברט א. וולש (מענק F-0020) על תמיכתה בתוכנית המחקר של קבוצת Lu באוניברסיטת טקסס באוסטין.

1. הכנת ריאגנטים ומאגרים
<ol><li>הכינו 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) על ידי הוספת 0.9 M Tris-base, 0.9 M חומצה בורית, 20 mM EDTA (מלח דיסודיום) ומים נטולי יונים, לנפח סופי של 1 L. ערבבו עד שכל הרכיבים מומסים.</li>
	<li>הכינו תמיסת מלאי פוליאקרילאמיד 10% דנטורינג באופן הבא. בבקבוק זכוכית של 250 מ"ל, הוסף 120 גרם של אוריאה (8 M), ...

SELEX מאפשר לא רק זיהוי של aptamers עם זיקה גבוהה, בטווח pM-nM 22,43,44,45, אלא גם עם סלקטיביות גבוהה ו tunable . על ידי ניצול הבחירה הנגדית, ניתן להשיג אפטמרים עם סלקטיביות מאתגרת. לדוגמה, קבוצת Li הדגימה את היכולת להשיג רצפים שיכולים להבד?...

להידבקות בנגיף יש השפעות כלכליות וחברתיות עצומות ברחבי העולם, כפי שהתברר יותר ויותר ממגפת הקורונה האחרונה. אבחון מדויק בזמן הוא בעל חשיבות עליונה בטיפול בזיהומים ויראליים תוך מניעת התפשטות וירוסים לאנשים בריאים. בעוד שיטות רבות לזיהוי וירוסים פותחו, כגון בדיקות PCR1,2 ו inmunoassays3, רוב השיטות בשימוש כיום אינן מסוגלות לקבוע אם הנגיף שזוהה הוא באמת מדבק או לא. הסיבה לכך היא שנוכחותם של רכיבי הנגיף בלבד, כגון חומצת גרעין נגיפית או חלבונים, אינה מעידה על כך שהנגיף השלם והמדבק קיים, ורמות של סמנים ביולוגיים אלה הראו מתאם גרוע עם הדבקה 4,5,6. לדוגמה, RNA נגיפי, המשמש בדרך כלל לבדיקות COVID-19 מבוססות PCR הנוכחיות, יש רמות נמוכות מאוד בשלבים המוקדמים של ההדבקה כאשר החולה מדבק, בעוד שרמת ה- RNA לעתים קרובות עדיין גבוהה מאוד כאשר החולים החלימו מהזיהום ואינם מדבקים עוד 7,8. החלבון הנגיפי או הסמנים הביולוגיים של האנטיגן עוקבים אחר מגמה דומה, אך בדרך כלל מופיעים אפילו מאוחר יותר מהרנ"א הנגיפי ולכן הם אפילו פחות מנבאים הדבקה 6,9. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פותחו כמה שיטות שיכולות ליידע על מצב ההדבקה של הנגיף, אך מבוססות על טכניקות מיקרוביולוגיה של תרבית תאים הדורשות זמן רב (ימים או שבועות) כדי להשיג תוצאות 4,10. לפיכך, פיתוח חיישנים חדשים שיכולים ליידע על יכולת ההדבקה של דגימות קליניות או סביבתיות יכול למנוע עיכובים בטיפול והתפשטות נוספת של הנגיף. עם זאת, מעט מאוד שיטות יכולות להשיג מולקולות חישה שיכולות לזהות ויריון זיהומי שלם ולהבדיל אותו מאותו וירוס שהפך ללא מדבק.
בהקשר זה, aptamers מתאימים במיוחד ככלי ביומולקולרי ייחודי11,12,13,14. Aptamers הם מולקולות DNA או RNA קצרות וחד-גדיליות עם רצף נוקלאוטידים ספציפי המאפשר להן ליצור קונפורמציה תלת-ממדית ספציפית כדי לזהות מטרה בעלת זיקה וסלקטיביות גבוהה15,16. הם מתקבלים על ידי תהליך בחירה קומבינטורי שנקרא אבולוציה שיטתית של ליגנדות על ידי העשרה מעריכית (SELEX), הידוע גם בשם בחירת מבחנה, המתבצעת במבחנות עם ספריית דגימת DNA אקראית גדולה של 10 14-1015 רצפים17,18,19. בכל סבב של תהליך איטרטיבי זה, מאגר הדנ"א נתון תחילה ללחץ ברירה באמצעות דגירה עם המטרה בתנאים הרצויים. כל הרצפים שאינם קשורים למטרה מוסרים לאחר מכן, ומשאירים מאחור רק את הרצפים המעטים שמסוגלים להיקשר בתנאים הנתונים. לבסוף, הרצפים שנבחרו בשלב הקודם מוגברים על ידי PCR, מעשירים את אוכלוסיית המאגר ברצפים הפונקציונליים הרצויים לסבב הבחירה הבא, והתהליך חוזר על עצמו. כאשר הפעילות של מאגר הבחירה מגיעה לרמה (בדרך כלל לאחר 8-15 סבבים), הספרייה מנותחת על ידי ריצוף DNA כדי לזהות את הרצפים המנצחים המפגינים את האהדה הגבוהה ביותר.
ל-SELEX יתרונות ייחודיים שניתן לנצל כדי להשיג סלקטיביות מוגברת מול יעדים דומים אחרים20,21, כגון למצב ההדבקה של הנגיף 22. ראשית, ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגים שונים של מטרות לבחירה, החל ממולקולות קטנות וחלבונים ועד פתוגנים שלמים ותאים16. לכן, כדי להשיג אפטמר שנקשר לווירוס מדבק, וירוס שלם יכול לשמש כמטרה, במקום חלבון פני השטח הנגיפי19. וירוס שלם SELEX מאפשר בחירה של aptamers שנקשרים במיוחד למצב המקורי של הנגיף, ללא צורך בשיבוש של הנגיף. שנית, SELEX יכול להיות מותאם אישית כדי להסיר מטרות מתחרות 21,23, כגון וירוסים דומים אחרים או וירוסים מומתים שאינם זיהומיים, באמצעות שלבי בחירה מונה בכל סבב של בחירה22. במהלך שלבי בחירת המונה, מאגר הדנ"א נחשף למטרות שעבורן אין צורך בקשירה, וכל הרצפים שנקשרים מושלכים.
בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול שניתן ליישם באופן כללי לבחירת אפטמרים הנקשרים לווירוס מדבק אך לא לאותו וירוס שהפך ללא מדבק על ידי שיטת חיטוי מסוימת או לווירוסים קשורים אחרים. שיטה זו מאפשרת לקבל סוכני זיהוי על סמך הבדלים פונקציונליים של פני השטח של הנגיף, אשר אינם צריכים להיות ידועים מראש, ובכך מציעה יתרון נוסף לאיתור פתוגנים חדשים או עבור מחלות שלא נחקרו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

לזיהומים בנגיף יש השפעה גדולה על החברה; רוב שיטות הגילוי מתקשות לקבוע אם נגיף שזוהה הוא מדבק, מה שגורם לעיכובים בטיפול ולהתפשטות נוספת של הנגיף. פיתוח חיישנים חדשים שיכולים ליידע על יכולת ההדבקה של דגימות קליניות או סביבתיות יעמוד באתגר שלא נענה. עם זאת, מעט מאוד שיטות יכולות להשיג מולקולות חישה שיכולות לזהות וירוס זיהומי שלם ולהבדיל אותו מאותו וירוס שהפך ללא מדבק בשיטות חיטוי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבחירת אפטמרים שיכול להבחין בין וירוסים זיהומיים לעומת וירוסים לא זיהומיים באמצעות אבולוציה שיטתית של ליגנדות על ידי העשרה מעריכית (SELEX). אנו מנצלים שתי תכונות של SELEX. ראשית, SELEX יכול להיות מותאם אישית כדי להסיר מטרות מתחרות, כגון וירוסים לא זיהומיים או וירוסים דומים אחרים, באמצעות בחירה נגדית. בנוסף, הנגיף כולו יכול לשמש כמטרה עבור SELEX, במקום, למשל, חלבון פני השטח הנגיפי. וירוס שלם SELEX מאפשר בחירה של aptamers שנקשרים במיוחד למצב המקורי של הנגיף, ללא צורך לשבש את הנגיף. שיטה זו מאפשרת אפוא לקבל סוכני זיהוי על בסיס הבדלים פונקציונליים בפני השטח של פתוגנים, אשר אינם צריכים להיות ידועים מראש.

מכיוון שניתן להשיג אפטמרים של דנ"א באמצעות SELEX במבחנה15, אסטרטגיית SELEX זו תוכננה בקפידה כדי לכלול הן שלבי ברירה חיוביים לקראת הנגיף המדבק השלם והשלם (כלומר, לשמור על מולקולות הדנ"א שנקשרות לווירוס המדבק), כמו גם שלבי בחירה נגדיים עבור אותו וירוס שהפך ללא מדבק בשיטת חיטוי מסוימת, ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

אנו מספקים פרוטוקול שניתן ליישם באופן כללי על אפטמרים נבחרים הנקשרים לווירוסים זיהומיים בלבד ולא לווירוסים שהפכו ללא מדבקים בשיטת חיטוי או לכל וירוסים דומים אחרים. זה פותח את האפשרות לקבוע את מצב ההדבקה בבדיקות ניידות ומהירות.

בחירה חוץ גופית של Aptamers כדי להבדיל וירוסים זיהומיים ולא זיהומיים

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבחור אפטמרים של DNA שיכולים להבחין בין וירוסים זיהומיים לעומת וירוסים לא זיהומיים על מנת לקבל מולקולת חישה המסוגלת ליידע את יכולת ההדבקה של דגימות קליניות או סביבתיות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי להשיג aptamers סלקטיבי עבור וירוסים רבים אחרים, כולל וירוסים מתעוררים, כי זה לא דורש ידע מוקדם של מבנים או רצפים של הנגיף. טכניקה זו מאפשרת פיתוח חיישני אפטמר לאבחון קליני וניטור סביבתי של וירוסים זיהומיים כדי לזהות אם מישהו מדבק או אם שיטת חיטוי סביבתית פועלת כמתוכנן.בחירה יכולה להיות תהליך קשה, במיוחד עבור אלה חדשים בו. חשוב לייעל את תנאי ה-PCR ולעקוב אחר התקדמות הבחירה באמצעות qPCR. מי שידגים את ההליך יהיה מרקוס גרמג'ו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, עצבו את ספריית ה-DNA החד-גדילית או SS-DNA הראשונית ואת הפריימרים. השג את אוליגוס הדנ"א ממקורות מסחריים עם טיהור התפלה סטנדרטי. טיהור ספריית SS-DNA ופריימרים על אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד 10% דנטורינג ואחריו משקעים אתנול.לאחר מכן, להשיג פתרון מלאי של וירוסים זיהומיות ולא זיהומיות או להכין אותם כמתואר בכתב היד טקסט. עבור דנטורציה של ספריית SS-DNA, ערבבו 10 מיקרוליטרים של ספריית SS-DNA 100 מיקרומולרית עם 240 מיקרוליטר של מאגר SELEX. מחממים את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות באמבטיה יבשה, ולאחר מכן מניחים את הצינור על קרח במשך 15 דקות.ערבבו 250 מיקרוליטר של ספריית SS-DNA במאגר SELEX עם 50 מיקרוליטר של וירוס מדבק לברירה חיובית. דוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של רצף T20 מילימולרי אחד למסנן 0.5 מיליליטר כדי לחסום את האתרים הלא ספציפיים.דגרו על הפילטרים למשך 30 דקות. צנטריפוגה את המסנן ב 14, 000 G במשך 10 דקות כדי להסיר את פתרון T20. לאחר מכן שטפו את המסנן שלוש פעמים עם מאגר SELEX כדי להסיר רצפי T20 עודפים.לאחר מכן, הוסף את תערובת הווירוסים הזיהומיים של ספריית SS-DNA למסנן 100 קילודלטון ולצנטריפוגה החסומים כדי לשטוף רצפים לא קשורים. שטפו את המסנן שלוש פעמים על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של חיץ SELEX וצנטריפוגה. שמור את השבר במסנן והשמט את הזרימה.כדי לשלול רצפים קשורים, שנה את צינור האיסוף של מסנן הצנטריפוגות והוסף 300 מיקרוליטר של חיץ SELEX המכיל שמונה אוריאה טוחנת למסנן. חממו את המסנן בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה כדי לאסוף את הזרימה המכילה את הרצפים המדוללים. לאחר שתסיים, שטפו את החומרים עם 10% אקונומיקה.לאחר מכן, הוסף את תמיסת הנגיף הזיהומי SS-DNA שנאספה בשלב הקודם למסנן חסום של 10 קילודלתון, צנטריפוגה ב -14, 000 גרם למשך 15 דקות והשליך את הזרימה. שטפו את המסנן שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר של חיץ SELEX כדי להסיר את האוריאה בצנטריפוגה ולהשליך את הזרימה. לשחזר את הפתרון במסנן על ידי הפיכתו בצינור איסוף נקי צנטריפוגה במשך חמש דקות.מדוד את הנפח הסופי של התמיסה המשוחזרת באמצעות פיפטה ותייג אותה כמדגם עגול 1A. קח 90% ממדגם סבב 1A כתבנית בסבב הראשון והפעל את ה- PCR בתנאים אופטימליים. כדי לשחזר SS-DNA באמצעות streptavidin שונה חרוזים מגנטיים או MB, לפצל את המוצר 50 aliquots מיקרוליטר ולהוסיף אותם צינורות microcentrifuge המכילים 50 מיקרוליטר MB. לדגור על הצינור במשך 30 דקות עם תסיסה קלה בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הניחו את הצינור על המדף המגנטי כדי לבודד את ה-MB והסירו את הסופרנאטנט על ידי פיפטציה. שטפו את ה-MB פעמיים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של חיץ קשירה ושטיפה לצינור. לאחר מכן הסר את הצינור מהמדף המגנטי והקש עליו לפני שתשהה מחדש את ה- MB לתמיסה הומוגנית על ידי פיפטציה.הניחו את הצינור שוב על המדף המגנטי והוציאו את הסופרנטנט. לאחר השטיפה השנייה, להשעות מחדש את MB ב 100 מיקרוליטר של מאגר SELEX ולחמם את התמיסה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הניחו מיד את הצינור במדף המגנטי ואספו את הסופרנאטנט המכיל את מאגר ה-SS-DNA.חזור על שלב התאוששות זה והוסף 50 מיקרוליטר של מאגר SELEX. מדוד את הנפח הסופי של החלק המשוחזר ותייג אותו כ- Round 1X. עבור דנטורציה של מאגר SS-DNA, לקחת 60% של דגימת Round 1X ולערבב אותו עם 50 מיקרוליטר של מאגר SELEX.מחממים את הדגימה באמבטיה יבשה, ואז מניחים את הצינור על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, ערבבו את מאגר הדנ"א SS-DNA מפורק במאגר SELEX עם 50 מיקרוליטר של כל וירוס כשלב הבחירה הנגדית ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר חסימת האתרים הלא ספציפיים במסנני צנטריפוגות, הוסיפו את מאגר SS-DNA מפורק המודגר בתמיסת וירוסים למסנן חסום של 100 קילודלטון.צנטריפוגה את המסנן ב 14, 000 G במשך 10 דקות ולאסוף את הזרימה דרך. קח 300 מיקרוליטר של שבר וערבב עם 50 מיקרוליטר של וירוס זיהומיות המכיל 100 מיליון עותקים למיליליטר. דוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.הכינו תערובת מאסטר סטנדרטית של qPCR ודילול של ספריית SS-DNA מטוהרת כמתואר בטקסט. הפעל את ה- qPCR כדי לקבוע את מחזור הסף. לאחר הריצה, השתמש בעקומה סטנדרטית כדי לכמת את כמות SS-DNA בסבב 1A ובסיבוב 1X.לאחר מכן חשב את תפוקת האלוציה ככמות הדנ"א המאוגדת חלקי כמות הדנ"א הראשונית והתווה את תפוקת האלוציה לעומת המספר העגול. לבסוף, שרטט את עקומות ההיתוך לסבבים שונים. לריצוף בתפוקה גבוהה, בחר ערכה מתאימה הזמינה מסחרית.הכינו מאגרים מרובים של סבבי בחירה המייצגים העשרה גבוהה, בינונית ונמוכה, וכן את המאגר הסופי באמצעות זוג אינדקסים שונים במתאמים לכל מאגר. לאחר מכן שלח את הספרייה הסופית שהוכנה למתקן הרצף. לצורך ניתוח ריצוף, הרצפים בוטלו על ידי מתקן הריצוף.הסר את מתאמי הרצף ואת פריימרים הבחירה באמצעות תוכנית שורת הפקודה Cutadapt. לאחר מכן השתמש בתוכנית FASTX-Toolkit כדי להסיר רצפים באיכות נמוכה. לאחר מכן מזג את קובצי הרצף בכיוון ההפוך עם קובצי הכיוון קדימה באמצעות הפונקציה FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ משלימה בקובצי הכיוון ההפוך.לאחר מכן השתמש בתוכנית CAT המובנית כדי למזג את הקבצים לקובץ יחיד. השתמש בערכת הכלים לניתוח FASTAptamer כדי לנתח את העשרת הרצפים במאגרי בחירה שונים. תחילה, כדי להשתמש בפונקציות ספירת FASTAptamer ואשכול FASTAptamer כדי לקבץ רצפים דומים לאשכולות.לאחר מכן, השתמש בפונקציית ההעשרה FASTAptamer כדי לקבל מידע על העשרת רצפים ואשכולות. זהה את רצפי האפטמר המועמדים מתוך מידע ההעשרה המתקבל באמצעות ניתוח רצפים. בחר מספר רצפי אפטמר ובצע סינון ראשוני באמצעות בדיקת קשירה.בניתוח זה, qPCR שימש כדי לעקוב אחר התקדמות SELEX של aptamers ספציפיים זיהומיות SARS-CoV-2. תשואת ה-elution עלתה בתחילה עם כל סבב של SELEX והתייצבה בסבבים שמונה ותשעה. על ידי השוואת עקומות ההיתוך, נצפה שינוי מהשיא בטמפרטורת התכה גבוהה מ-77 ל-79 מעלות צלזיוס.יתר על כן, בשני הסבבים האחרונים נצפתה שיא בטמפרטורת התכה נמוכה. השפע היחסי בקריאות למיליון עבור הרצף SARS2 AR10 שהתקבל במהלך סבבי בחירה רצופים מוצג. המבנה החזוי של SARS2 AR10 הראה מבנה משני מובנה המכיל אזור לולאת גזע שעשוי להיות מעורב בזיהוי הנגיף.לאחר קבלת אפטמרים, ניתן לשלב אותם באופטיקה חשמלית, סוג אחר של חיישנים, כדי לפתח פורטל ובדיקת זיהוי וירוסים מהירה שיכולה ליידע על הדבקת הנגיף. אנו רואים לנגד עינינו כי ניתן להשיג אפטמר ספציפי לווריאנטים שונים או סטריאוטיפים שונים של הנגיף, מה שיאפשר ניטור מהיר של וריאנטים שהם האיום הגדול ביותר על החברה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

ניצול של זיזי סיליקון המיקרוסקופים כדי להעריך את התפקוד נייד התכווצות<em&gt; במבחנה</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Ocular כדי לבדוק עדשות מגע

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...