Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
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Desideriamo ringraziare la Sig.ra Laura M. Cooper e il Dr. Lijun Rong dell'Università dell'Illinois a Chicago per aver fornito i campioni di pseudovirus utilizzati in questo protocollo (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), così come il Dr. Alvaro Hernandez e il Dr. Chris Wright della struttura DNA Services del Roy J. Carver Biotechnology Center presso l'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign per la loro assistenza con il sequenziamento ad alto rendimento, e molti membri del gruppo Lu che ci hanno aiutato con la selezione in vitro e le tecniche di caratterizzazione degli aptameri . Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione RAPID della National Science Foundation (CBET 20-29215) e da una sovvenzione seed dell'Istituto per la sostenibilità, l'energia e l'ambiente presso l'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign e l'Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. ringrazia la PEW Latin American Fellowship per il sostegno finanziario. Ringraziamo anche la Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) per il sostegno al programma di ricerca del gruppo Lu presso l'Università del Texas ad Austin.

1. Preparazione di reagenti e tamponi
<ol><li>Preparare 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) aggiungendo 0,9 M Tris-base, 0,9 M acido borico, 20 mM EDTA (sale disodico) e acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L. Mescolare fino a quando tutti i componenti sono sciolti.</li>
	<li>Preparare una soluzione madre di poliacrilammide denaturante al 10% come segue. In una bottiglia di vetro da 250 ml, aggiungere 120 g di urea (8 M), 25 ml di 10x TBE, 62,5 ml di soluzione al 40% di acrilammide/bisacrilammide (29:...

SELEX permette non solo l'identificazione di aptameri ad alta affinità, nell'intervallo pM-nM 22,43,44,45, ma anche con selettività elevata e sintonizzabile. Sfruttando la controselezione, è possibile ottenere aptameri con selettività impegnativa. Ad esempio, il gruppo Li ha dimostrato la capacità di ottenere sequenze in grado di differenziare i ceppi batterici patogeni dai ceppi non pato...

Le infezioni da virus hanno enormi impatti economici e sociali in tutto il mondo, come è diventato sempre più evidente dalla recente pandemia di COVID-19. Una diagnosi tempestiva e accurata è fondamentale nel trattamento delle infezioni virali e nella prevenzione della diffusione di virus a persone sane. Mentre sono stati sviluppati molti metodi di rilevamento dei virus, come i test PCR1,2 e i saggi inmunoassays3, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non sono in grado di determinare se il virus rilevato è effettivamente infettivo o meno. Questo perché la presenza di componenti del virus da solo, come l'acido nucleico virale o le proteine, non indica che il virus infettivo intatto sia presente e i livelli di questi biomarcatori hanno mostrato una scarsa correlazione con l'infettività 4,5,6. Ad esempio, l'RNA virale, comunemente usato per gli attuali test COVID-19 basati sulla PCR, ha livelli molto bassi nelle prime fasi dell'infezione quando il paziente è contagioso, mentre il livello di RNA è spesso ancora molto alto quando i pazienti sono guariti dall'infezione e non sono più contagiosi 7,8. I biomarcatori della proteina virale o dell'antigene seguono una tendenza simile, ma in genere appaiono anche più tardi dell'RNA virale e quindi sono ancora meno predittivi di infettività 6,9. Per ovviare a questa limitazione, sono stati sviluppati alcuni metodi che possono informare sullo stato di infettività del virus, ma si basano su tecniche di microbiologia di coltura cellulare che richiedono molto tempo (giorni o settimane) per ottenere risultati 4,10. Pertanto, lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull'infettività dei campioni clinici o ambientali può evitare ritardi nel trattamento e un'ulteriore diffusione del virus. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole di rilevamento in grado di riconoscere un virione infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo.
In questo contesto, gli aptameri sono particolarmente adatti come strumento biomolecolare unico11,12,13,14. Gli aptameri sono molecole corte di DNA o RNA a singolo filamento con una specifica sequenza nucleotidica che consente loro di formare una specifica conformazione 3D per riconoscere un bersaglio con elevata affinità e selettività15,16. Sono ottenuti mediante un processo di selezione combinatoria chiamato evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX), noto anche come selezione in vitro, che viene effettuato in provette con una grande libreria di campionamento casuale del DNA di 10 14-1015 sequenze17,18,19. In ogni ciclo di questo processo iterativo, il pool di DNA viene prima sottoposto a una pressione di selezione attraverso l'incubazione con il bersaglio nelle condizioni desiderate. Tutte le sequenze che non sono legate al bersaglio vengono quindi rimosse, lasciando dietro di sé solo quelle poche sequenze che sono in grado di legarsi nelle condizioni date. Infine, le sequenze che sono state selezionate nella fase precedente vengono amplificate dalla PCR, arricchendo la popolazione del pool con le sequenze funzionali desiderate per il prossimo round di selezione, e il processo viene ripetuto. Quando l'attività del pool di selezione raggiunge un plateau (tipicamente dopo 8-15 round), la biblioteca viene analizzata mediante sequenziamento del DNA per identificare le sequenze vincenti che mostrano la massima affinità.
SELEX ha vantaggi unici che possono essere sfruttati per ottenere una maggiore selettività contro altri bersagli simili20,21, come ad esempio per lo stato di infettività del virus 22. In primo luogo, un'ampia varietà di diversi tipi di bersagli può essere utilizzata per la selezione, da piccole molecole e proteine a interi patogeni e cellule16. Pertanto, per ottenere un aptamero che si lega a un virus infettivo, un virus intatto può essere utilizzato come bersaglio, invece di una proteina di superficie virale19. L'intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. In secondo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti 21,23, come altri virus simili o virus inattivati non infettivi, utilizzando fasi di selezione del contatore in ogni round di selezione22. Durante le fasi di selezione del contatore, il pool di DNA viene esposto a bersagli per i quali non è desiderato il legame e tutte le sequenze che si legano vengono scartate.
In questo lavoro, forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato per selezionare gli aptameri che si legano a un virus infettivo ma non allo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione o da un altro virus correlato. Questo metodo consente di ottenere agenti di riconoscimento in base alle differenze funzionali della superficie del virus, che non devono essere conosciute in anticipo, e offre quindi un ulteriore vantaggio per l'individuazione di agenti patogeni di recente emersione o per malattie poco studiate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

Le infezioni virali hanno un impatto importante sulla società; La maggior parte dei metodi di rilevamento ha difficoltà a determinare se un virus rilevato è infettivo, causando ritardi nel trattamento e ulteriore diffusione del virus. Lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull'infettività dei campioni clinici o ambientali soddisferà questa sfida insoddisfatta. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole sensibili in grado di riconoscere un virus infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo dai metodi di disinfezione. Qui, descriviamo un protocollo per selezionare gli aptameri in grado di distinguere i virus infettivi dai virus non infettivi utilizzando l'evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX). Sfruttiamo due caratteristiche di SELEX. In primo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti, come virus non infettivi o altri virus simili, utilizzando la selezione dei contatori. Inoltre, l'intero virus può essere utilizzato come bersaglio per SELEX, anziché, ad esempio, di una proteina virale di superficie. L'intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. Questo metodo consente quindi di ottenere agenti di riconoscimento sulla base di differenze funzionali nella superficie dei patogeni, che non devono essere conosciute in anticipo.

Poiché gli aptameri del DNA possono essere ottenuti utilizzando SELEX in una provetta15, questa strategia SELEX è stata attentamente progettata per includere sia le fasi di selezione positiva verso il virus infettivo intatto e intero (cioè, mantenere le molecole di DNA che si legano al virus infettivo), sia le fasi di controselezione per lo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione, in particolare il trattamento UV, scartando le sequenze di DNA che p...

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In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato a selezionare aptameri che si legano solo a virus infettivi e non a virus che sono stati resi non infettivi da un metodo di disinfezione o ad altri virus simili. Ciò apre la possibilità di determinare lo stato di infettività nei test portatili e rapidi.

Selezione in vitro di aptameri per differenziare i virus infettivi da quelli non infettivi

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Questo protocollo descrive come selezionare aptameri del DNA in grado di distinguere i virus infettivi dai virus non infettivi al fine di ottenere molecole sensibili in grado di informare l'infettività di campioni clinici o ambientali. Questa tecnica può essere applicata per ottenere aptameri selettivi per molti altri virus, compresi i virus emergenti, perché non richiede una conoscenza preliminare delle strutture o delle sequenze del virus. Questa tecnica consente lo sviluppo di sensori aptameri per la diagnostica clinica e il monitoraggio ambientale dei virus infettivi per rilevare se qualcuno è contagioso o se un metodo di disinfezione ambientale funziona come previsto.La selezione può essere un processo difficile, soprattutto per coloro che sono nuovi ad esso. È importante ottimizzare le condizioni della PCR e monitorare l'avanzamento della selezione con qPCR. A dimostrare la procedura sarà Marcos Gramajo, uno studente laureato del mio laboratorio.Per iniziare, progetta la libreria iniziale a singolo filamento o SS-DNA e i primer. Ottenere gli oligo di DNA da fonti commerciali con la purificazione di desalinizzazione standard. Purificare la libreria e i primer SS-DNA sull'elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante al 10% seguita da precipitazione di etanolo.Quindi, ottenere una soluzione madre di virus infettivi e non infettivi o prepararli come descritto nel manoscritto di testo. Per la denaturazione della libreria SS-DNA, mescolare 10 microlitri di 100 micromolari della libreria SS-DNA con 240 microlitri di tampone SELEX. Riscaldare la miscela a 95 gradi Celsius per 15 minuti in un bagno asciutto, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti.Mescolare 250 microlitri di libreria SS-DNA nel tampone SELEX con 50 microlitri di virus infettivo per una selezione positiva. Incubare per due ore a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 400 microlitri di una sequenza T20 millimolare a un filtro da 0,5 millilitri per bloccare i siti non specifici.Incubare i filtri per 30 minuti. Centrifugare il filtro a 14.000 G per 10 minuti per rimuovere la soluzione T20. Quindi lavare il filtro tre volte con tampone SELEX per rimuovere le sequenze T20 in eccesso.Quindi, aggiungere la miscela di virus infettivi della libreria SS-DNA al filtro da 100 kilodalton bloccato e alla centrifuga per lavare le sequenze non legate. Lavare il filtro tre volte aggiungendo 400 microlitri di tampone SELEX e centrifugazione. Mantenere la frazione nel filtro ed eliminare il flusso passante.Per eluire le sequenze legate, cambiare il tubo di raccolta del filtro centrifugo e aggiungere 300 microlitri di tampone SELEX contenente otto molari di urea al filtro. Riscaldare il filtro a 95 gradi Celsius per 15 minuti, quindi centrifugare per raccogliere il flusso contenente le sequenze eluite. Una volta fatto, lavare i materiali con il 10% di candeggina.Quindi, aggiungere la soluzione di virus infettivo SS-DNA raccolta nella fase precedente a un filtro da 10 kilodalton bloccato, centrifugare a 14.000 G per 15 minuti e scartare il flusso attraverso. Lavare il filtro tre volte con 300 microlitri di tampone SELEX per rimuovere l'urea mediante centrifugazione ed eliminare il flusso continuo. Recuperare la soluzione nel filtro capovolgendola in un tubo di raccolta pulito e centrifugando per cinque minuti.Misurare il volume finale della soluzione recuperata utilizzando una pipetta ed etichettarla come campione Round 1A. Prendi il 90% del campione del Round 1A come modello nel primo round ed esegui la PCR utilizzando condizioni ottimizzate. Per recuperare SS-DNA utilizzando sfere magnetiche modificate con streptavidina o MB, dividere il prodotto in aliquote da 50 microlitri e aggiungerle a provette da microcentrifuga contenenti 50 microlitri MB. Incubare il tubo per 30 minuti con lieve agitazione a temperatura ambiente.Quindi posizionare il tubo sul rack magnetico per isolare il MB e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Lavare il MB due volte aggiungendo 200 microlitri di legatura e tampone di lavaggio al tubo. Quindi rimuovere il tubo dal rack magnetico e picchiettarlo prima di risospendere il MB in una soluzione omogenea mediante pipettaggio.Posizionare nuovamente il tubo sul rack magnetico e rimuovere il surnatante. Dopo il secondo lavaggio, risospendere il MB in 100 microlitri di tampone SELEX e riscaldare la soluzione a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Posizionare immediatamente il tubo nel rack magnetico e raccogliere il surnatante contenente il pool di SS-DNA.Ripetere questo passaggio di recupero aggiungendo 50 microlitri di tampone SELEX. Misurare il volume finale della frazione recuperata ed etichettarla come Round 1X. Per la denaturazione del pool di SS-DNA, prelevare il 60% del campione Round 1X e mescolarlo con 50 microlitri di tampone SELEX.Riscaldare il campione in un bagno asciutto, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi, mescolare il pool di SS-DNA denaturato nel tampone SELEX con 50 microlitri di ciascun virus come fase di controselezione e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver bloccato i siti non specifici nei filtri centrifughi, aggiungere il pool di SS-DNA denaturato della miscela incubato con una soluzione virale a un filtro bloccato da 100 kilodalton.Centrifugare il filtro a 14.000 G per 10 minuti e raccogliere il flusso attraverso. Prendi 300 microlitri di frazione e mescola con 50 microlitri di virus infettivo contenente 100 milioni di copie per millilitro. Incubare per due ore a temperatura ambiente.Preparare una master mix qPCR standard e diluizioni della libreria SS-DNA purificata come descritto nel testo. Eseguire la qPCR per determinare il ciclo di soglia. Dopo la corsa, utilizzare una curva standard per quantificare la quantità di SS-DNA nel Round 1A e nel Round 1X.Quindi calcolare la resa di eluizione come quantità di DNA legato divisa per la quantità iniziale di DNA e tracciare la resa di eluizione rispetto al numero tondo. Infine, tracciate le curve di fusione per diversi arrotondamenti. Per un sequenziamento a throughput elevato, selezionare un kit appropriato disponibile in commercio.Preparare più pool di cicli di selezione che rappresentano l'arricchimento alto, medio e basso, nonché il pool finale utilizzando una coppia diversa di indici negli adattatori per ogni pool. Quindi inviare la libreria finale preparata alla struttura di sequenziamento. Per l'analisi di sequenziamento, le sequenze sono state demultiplexate dalla funzione di sequenziamento.Rimuovere gli adattatori di sequenziazione e i primer di selezione utilizzando il programma a riga di comando Cutadapt. Quindi utilizzare il programma FASTX-Toolkit per rimuovere le sequenze di bassa qualità. Quindi unire i file di sequenza nella direzione inversa con quelli nella direzione di avanzamento utilizzando la funzione complementare di FASTX_reverse_ FASTX-Toolkit sui file di direzione inversa.Quindi utilizzare il programma CAT integrato per unire i file in un singolo file. Utilizzare il toolkit di analisi FASTAptamer per analizzare l'arricchimento delle sequenze in diversi pool di selezione. Innanzitutto, utilizzare le funzioni FASTAptamer count e FASTAptamer cluster per raggruppare sequenze simili in cluster.Successivamente, utilizzare la funzione FASTAptamer enrich per ottenere informazioni sull'arricchimento di sequenze e cluster. Identificare le sequenze di aptameri candidati dalle informazioni di arricchimento ottenute attraverso l'analisi delle sequenze. Selezionare diverse sequenze di aptameri ed eseguire lo screening iniziale utilizzando un test di legame.In questa analisi, la qPCR è stata utilizzata per monitorare i progressi di SELEX degli aptameri infettivi specifici di SARS-CoV-2. La resa di eluizione è inizialmente aumentata ad ogni round di SELEX e livellata ai round otto e nove. Confrontando le curve di fusione, è stato osservato uno spostamento dal picco ad alta temperatura di fusione da 77 a 79 gradi Celsius.Inoltre, negli ultimi due round, è stato osservato un picco a bassa temperatura di fusione. Viene mostrata l'abbondanza relativa di letture per milione per il SARS2 AR10 sequenziato ottenuto in turni di selezione consecutivi. La struttura prevista di SARS2 AR10 ha mostrato una struttura secondaria strutturata contenente una regione dell'anello staminale che potrebbe essere coinvolta nel riconoscimento del virus.Una volta ottenuti, gli aptameri possono essere incorporati nell'ottica elettrica, un altro tipo di sensori, per sviluppare portali e test rapidi di rilevamento dei virus in grado di informare l'infettività del virus. Prevediamo che sia possibile ottenere aptameri specifici per diverse varianti o stereotipi di virus, rendendo possibile un rapido monitoraggio delle varianti che sono la più grande minaccia per la società.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Ricerca

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The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

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