Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
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このプロトコルで使用された疑似ウイルスサンプル(SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、H5N1)を提供してくれたイリノイ大学シカゴ校のローラM.クーパー氏とリジュンロン博士、およびイリノイ大学アーバナシャンペーン校のロイJ.カーバーバイオテクノロジーセンターのDNAサービス施設のアルバロヘルナンデス博士とクリスライト博士に、ハイスループットシーケンシングを支援してくれたことに感謝します。 そして、in vitro 選択とアプタマーの特性評価技術で私たちを助けてくれたLuグループの多くのメンバー。この研究は、国立科学財団からのRAPID助成金(CBET 20-29215)と、イリノイ大学アーバナシャンペーン校およびイリノイ大学JITRI研究所の持続可能性、エネルギー、環境研究所からのシード助成金(JITRI 23965)によってサポートされました。A.S.P.は、PEWラテンアメリカフェローシップの財政的支援に感謝します。また、テキサス大学オースティン校のLuグループ研究プログラムを支援してくれたロバートA.ウェルチ財団(助成金F-0020)にも感謝します。

1. 試薬およびバッファーの調製
<ol><li>0.9 Mトリス塩基、0.9 Mホウ酸、20 mM EDTA(二ナトリウム塩)、および脱イオン水を最終容量1 Lまで加えて、10xホウ酸トリスEDTA(10x TBE)を調製します。</li>
	<li>以下のようにして10%変性ポリアクリルアミド原液を調製する。250 mL のガラス瓶に、尿素 120 g (8 M)、10x TBE 25 mL、40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド (29:1) 溶液 62.5 mL、および最終容量 250 m...

SELEXは、pM-nM範囲22,43,44,45の高い親和性を有するアプタマーの同定だけでなく、高い調整可能な選択性を有するアプタマーの同定も可能にする。カウンター選択を利用することで、難しい選択性を有するアプタマーを得ることができます。例えば、Liグループは、病原性細菌株を非病原性株から区?...

ウイルス感染は、最近のCOVID-19パンデミックからますます明らかになったように、世界中で甚大な経済的および社会的影響を及ぼしています。タイムリーで正確な診断は、健康な人へのウイルスの拡散を防ぎながらウイルス感染症を治療する上で最も重要です。PCR検査1,2やインミュノアッセイ3など、多くのウイルス検出法が開発されていますが、現在使用されている方法のほとんどは、検出されたウイルスが実際に感染性であるかどうかを判断できません。これは、ウイルス核酸やタンパク質などのウイルスの成分のみの存在は、無傷の感染性ウイルスが存在することを示すものではなく、これらのバイオマーカーのレベルは感染性との相関が低いことを示しているためです4,5,6。たとえば、現在のPCRベースのCOVID-19検査で一般的に使用されているウイルスRNAは、患者が伝染性である場合、感染の初期段階では非常に低いレベルを示しますが、患者が感染から回復し、もはや伝染性ではなくなった場合、RNAレベルは依然として非常に高いことがよくあります7,8。ウイルスタンパク質または抗原バイオマーカーも同様の傾向に従いますが、通常はウイルスRNAよりもさらに遅く現れるため、感染性の予測はさらに低くなります6,9。この制限に対処するために、ウイルスの感染状態を知らせることができるいくつかの方法が開発されているが、結果を得るために長い時間(数日または数週間)を必要とする細胞培養微生物学的技術に基づいている4,10。したがって、臨床サンプルまたは環境サンプルの感染性を通知できる新しいセンサーを開発することで、治療の遅延やウイルスのさらなる拡散を回避できます。しかし、無傷の感染性ビリオンを認識し、非感染性にされた同じウイルスと区別できるセンシング分子を得ることができる方法はほとんどありません。
この文脈において、アプタマーは、ユニークな生体分子ツール11、12、13、14として特に適している。アプタマーは、特定の塩基配列を持つ短い一本鎖DNAまたはRNA分子であり、特定の3D立体配座を形成して、高い親和性と選択性でターゲットを認識することができます15,16。それらは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)と呼ばれる組み合わせ選択プロセスによって得られ、in vitro選択としても知られ、10 14-10 15配列17,18,19の大きなランダムDNAサンプリングライブラリを備えた試験管で実行されます.この反復プロセスの各ラウンドにおいて、DNAプールは、最初に、所望の条件下で標的とのインキュベーションを通じて選択圧を受ける。ターゲットにバインドされていない配列はすべて削除され、指定された条件下で結合できる少数の配列のみが残ります。最後に、前のステップで選択された配列はPCRによって増幅され、プールの集団を次の選択ラウンドのために所望の機能配列で濃縮し、このプロセスが繰り返される。選択プールの活性がプラトーに達すると(典型的には8〜15ラウンド後)、ライブラリーをDNAシーケンシングによって分析し、最も高い親和性を示す勝利配列を同定する。
SELEXは、ウイルス22の感染性状態など、他の類似の標的20、21に対する選択性を高めるために利用され得る独自の利点を有する。第1に、小分子およびタンパク質から病原体および細胞全体まで、多種多様な異なるタイプの標的を選択に使用することができる16。したがって、感染性ウイルスに結合するアプタマーを得るために、ウイルス表面タンパク質19の代わりに、無傷のウイルスを標的として使用することができる。全ウイルスSELEXは、ウイルスの破壊を必要とせずに、ウイルスの天然状態に特異的に結合するアプタマーの選択を可能にします。第2に、SELEXは、選択22の各ラウンドにおけるカウンター選択ステップを使用して、他の類似のウイルスまたは非感染性不活化ウイルスなどの競合する標的21、23を除去するようにテーラーメイドすることができる。カウンター選択ステップの間、DNAプールは結合が望ましくない標的に曝露され、結合する配列はすべて破棄されます。
この研究では、感染性ウイルスに結合するが、特定の消毒方法によって非感染性にされた同じウイルスまたは他の関連ウイルスには結合しないアプタマーを選択するために一般的に適用できるプロトコルを提供します。この方法は、ウイルス表面の機能の違いに基づいて認識剤を得ることができ、事前に知る必要がないため、新たに出現した病原体の検出や未研究の疾患にさらに利点を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

ウイルス感染は社会に大きな影響を与えます。ほとんどの検出方法は、検出されたウイルスが感染性であるかどうかを判断するのが困難であり、治療の遅延とウイルスのさらなる拡散を引き起こします。臨床サンプルや環境サンプルの感染性を知らせることができる新しいセンサーを開発することで、この満たされていない課題に対処できます。しかし、無傷の感染性ウイルスを認識し、消毒法によって非感染性にされた同じウイルスと区別できるセンシング分子を得ることができる方法はほとんどありません。ここでは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)を用いて、感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別できるアプタマーを選択するためのプロトコルについて説明します。SELEXの2つの機能を活用しています。まず、SELEXは、カウンター選択を使用して、非感染性ウイルスまたは他の同様のウイルスなどの競合するターゲットを削除するようにカスタマイズできます。さらに、ウイルス表面タンパク質の代わりに、ウイルス全体をSELEXの標的として使用することができる。全ウイルスSELEXは、ウイルスを破壊することなく、ウイルスの天然状態に特異的に結合するアプタマーの選択を可能にします。したがって、この方法は、事前に知る必要のない病原体の表面の機能の違いに基づいて認識剤を得ることを可能にする。

DNAアプタマーは試験管15内でSELEXを用いて得ることができるので、このSELEX戦略は、無傷の感染性ウイルス全体に対するポジティブ選択ステップ(すなわち、感染性ウイルスに結合するDNA分子を保持する)と、特定の消毒方法によって非感染性にされた同じウイルスに対するカウンター選択ステップの両方を含むように慎重に設計され、 具体的にはUV処理は、非感染性ウイルス?...

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In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

感染性ウイルスのみに結合し、消毒法によって非感染性にされたウイルスや他の同様のウイルスには結合しない選択されたアプタマーに一般的に適用できるプロトコルを提供します。これにより、ポータブルで迅速なテストで感染状態を判断する可能性が開かれます。

感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別するためのアプタマーのin vitro選択

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

このプロトコルでは、臨床サンプルまたは環境サンプルの感染性を通知できるセンシング分子を取得するために、感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別できるDNAアプタマーを選択する方法について説明します。この技術は、ウイルスの構造や配列に関する事前の知識を必要としないため、新興ウイルスを含む他の多くのウイルスの選択的アプタマーを取得するために適用できます。この技術により、感染性ウイルスの臨床診断および環境モニタリング用のアプタマーセンサーを開発し、誰かが伝染性であるかどうか、または環境消毒方法が意図したとおりに機能するかどうかを検出できます。選択は、特にそれに不慣れな人にとっては難しいプロセスになる可能性があります。PCR条件を最適化し、qPCRで選択の進行状況を監視することが重要です。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるマルコス・グラマホです。まず、最初の一本鎖またはSS-DNAライブラリーとプライマーを設計します。標準的な脱塩精製により、市販のソースからDNAオリゴを入手します。SS-DNAライブラリとプライマーを10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くエタノール沈殿で精製します。次に、感染性および非感染性ウイルスの原液を入手するか、テキスト原稿に記載されているようにそれらを準備します。SS-DNAライブラリーの変性には、10マイクロリットルの100マイクロモルSS-DNAライブラリーを240マイクロリットルのSELEXバッファーと混合します。混合物を95°Cで乾浴中で15分間加熱し、次にチューブを氷の上に15分間置きます。SELEXバッファー中の250マイクロリットルのSS-DNAライブラリを50マイクロリットルの感染性ウイルスと混合して、ポジティブセレクションを行います。室温で2時間インキュベートします。次に、400マイクロリットルの1ミリモルのT20配列を0.5ミリリットルのフィルターに加えて、非特異的部位をブロックします。フィルターを30分間インキュベートします。フィルターを14, 000 Gで10分間遠心分離してT20溶液を除去します。次に、フィルターをSELEXバッファーで3回洗浄して、余分なT20シーケンスを除去します。次に、SS-DNAライブラリ感染性ウイルス混合物をブロックされた100キロダルトンフィルターおよび遠心分離機に加えて、未結合配列を洗浄します。400マイクロリットルのSELEXバッファーを加えて遠心分離することにより、フィルターを3回洗浄します。フラクションをフィルターに保持し、フロースルーを廃棄します。結合した配列を溶出するには、遠心分離フィルターの収集チューブを交換し、8モル尿素を含む300マイクロリットルのSELEXバッファーをフィルターに追加します。フィルターを摂氏95度で15分間加熱し、遠心分離して溶出した配列を含むフロースルーを収集します。完了したら、10%の漂白剤で材料を洗います。次に、前のステップで収集したSS-DNA感染性ウイルス溶液をブロックされた10キロダルトンフィルターに加え、14, 000 Gで15分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。フィルターを300マイクロリットルのSELEXバッファーで3回洗浄し、遠心分離によって尿素を除去し、フロースルーを廃棄します。フィルター内の溶液を清潔な収集チューブで逆さまにして5分間遠心分離することにより、溶液を回収します。ピペットを使用して回収された溶液の最終容量を測定し、Round 1Aサンプルとしてラベル付けします。最初のラウンドでラウンド1Aサンプルの90%をテンプレートとして取得し、最適化された条件を使用してPCRを実行します。ストレプトアビジン修飾磁気ビーズまたはMBを使用してSS-DNAを回収するには、製品を50マイクロリットルのアリコートに分割し、50マイクロリットルのMBを含むマイクロ遠心チューブに追加します。室温で穏やかな攪拌でチューブを30分間インキュベートします。次に、チューブを磁気ラックに置き、MBを分離し、ピペッティングによって上清を除去します。200マイクロリットルの結合および洗浄バッファーをチューブに追加して、MBを2回洗浄します。次に、磁気ラックからチューブを取り外して軽くたたいてから、ピペッティングによってMBを均質な溶液に再懸濁します。チューブを磁気ラックに再度置き、上清を取り除きます。2回目の洗浄後、MBを100マイクロリットルのSELEXバッファーに再懸濁し、溶液を摂氏95度で10分間加熱します。すぐにチューブを磁気ラックに入れ、SS-DNAプールを含む上清を収集します。50マイクロリットルのSELEXバッファーを追加して、この回復手順を繰り返します。回収された画分の最終体積を測定し、Round 1Xとラベル付けします。SS-DNAプールを変性させるには、ラウンド1Xサンプルの60%を採取し、50マイクロリットルのSELEXバッファーと混合します。サンプルをドライバスで加熱し、チューブを氷の上に15分間置きます。次に、SELEXバッファー中の変性SS-DNAプールを、カウンター選択ステップとして50マイクロリットルの水各ウイルスと混合し、室温で1時間インキュベートします。遠心分離フィルターで非特異的部位をブロックした後、ウイルス溶液でインキュベートした変性SS-DNAプールをブロックされた100キロダルトンフィルターに加えます。フィルターを 14 , 000 G で 10 分間遠心分離し、フロースルーを収集します。300マイクロリットルの画分を取り、ミリリットルあたり1億コピーを含む50マイクロリットルの感染性ウイルスと混合する。室温で2時間インキュベートします。本文に記載されているように、標準的なqPCRマスターミックスと精製SS-DNAライブラリの希釈液を調製します。qPCRを実行して、しきい値サイクルを決定します。実行後、標準曲線を使用して、ラウンド1Aおよびラウンド1XのSS-DNAの量を定量化します。次に、結合DNA量を初期DNA量で割ったものとして溶出収率を計算し、溶出収率とラウンド数をプロットします。最後に、異なるラウンドの融解曲線をプロットします。ハイスループットシーケンシングの場合は、適切な市販キットを選択してください。高、中、低のエンリッチメントを表す選択ラウンドの複数のプールと、プールごとにアダプターで異なるインデックスのペアを使用して最終的なプールを準備します。次に、準備した最終ライブラリをシーケンシング施設に送ります。シーケンシング解析のために、シーケンシング機能はシーケンシング機能によって逆多重化されています。コマンドラインプログラムCutadaptを使用して、シーケンシングアダプターと選択プライマーを削除します。次に、FASTX-Toolkitプログラムを使用して、低品質のシーケンスを削除します。次に、逆方向ファイルに対してFASTX-Toolkit FASTX_reverse_補完機能を使用して、逆方向のシーケンスファイルと順方向のシーケンスファイルをマージします。次に、組み込みのCATプログラムを使用して、ファイルを1つのファイルにマージします。FASTAptamer 解析ツールキットを使用して、異なる選択プールにわたる配列の濃縮を分析します。まず、FASTAptamer カウント関数と FASTAptamer クラスター関数を使用して、類似したシーケンスをクラスターにグループ化します。次に、FASTAptamer エンリッチ関数を使用して、シーケンスとクラスターのエンリッチメントに関する情報を取得します。配列解析により得られた濃縮情報から候補アプタマー配列を同定する。複数のアプタマー配列を選択し、結合アッセイを用いて初期スクリーニングを行います。この分析では、qPCRを使用して、感染性SARS-CoV-2特異的アプタマーのSELEXの進行状況を監視しました。溶出収率は、SELEXの各ラウンドで最初に増加し、ラウンド8と9で水平になりました。融解曲線を比較すると、77°Cから79°Cの高融解温度でのピークからのシフトが観察された。また、最後の2ラウンドでは、低い融解温度でピークが観察された。連続した選択ラウンドで得られた配列決定されたSARS2 AR10の100万回あたりのリード数の相対存在量が示されています。SARS2 AR10の予測された構造は、ウイルスの認識に関与する可能性のあるステムループ領域を含む構造化された二次構造を示しました。アプタマーが得られたら、別のタイプのセンサーである電気光学に組み込んで、ウイルス感染力を知らせることができるポータルおよび迅速なウイルス検出テストを開発できます。ウイルスの異なる変異体やステレオタイプに特異的なアプタマーが得られ、社会にとって最大の脅威となる変異株の迅速なモニタリングが可能になると考えています。

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