Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

Vi ønsker å takke Laura M. Cooper og Dr. Lijun Rong fra University of Illinois i Chicago for å ha gitt pseudovirusprøvene som brukes i denne protokollen (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), samt Dr. Alvaro Hernandez og Dr. Chris Wright fra DNA Services-anlegget til Roy J. Carver Biotechnology Center ved University of Illinois i Urbana-Champaign for deres hjelp med høykapasitetssekvensering, og mange medlemmer av Lu-gruppen som har hjulpet oss med in vitro-seleksjon og aptamer-karakteriseringsteknikker. Dette arbeidet ble støttet av et RAPID-stipend fra National Science Foundation (CBET 20-29215) og et frøstipend fra Institute for Sustainability, Energy and Environment ved University of Illinois i Urbana-Champaign og Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). ASP takker PEW Latin American Fellowship for økonomisk støtte. Vi takker også Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) for støtte til Lu-gruppens forskningsprogram ved University of Texas i Austin.

1. Fremstilling av reagenser og buffere
<ol><li>Forbered 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) ved å tilsette 0,9 M Tris-base, 0,9 M borsyre, 20 mM EDTA (dinatriumsalt) og avionisert vann til et endelig volum på 1 L. Bland til alle komponentene er oppløst.</li>
	<li>Forbered en 10% denaturerende polyakrylamidoppløsning som følger. I en 250 ml glassflaske, tilsett 120 g urea (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% akrylamid/bisakrylamid (29:1) oppløsning og nok destillert vann til å nå det endelige volumet p?...

SELEX tillater ikke bare identifisering av aptamerer med høy affinitet, i pM-nM-området 22,43,44,45, men også med høy og justerbar selektivitet. Ved å dra nytte av tellervalg kan aptamere med utfordrende selektivitet oppnås. For eksempel har Li-gruppen vist evnen til å oppnå sekvenser som kan skille patogene bakteriestammer fra ikke-patogene stammer21. Le et al....

Virusinfeksjoner har enorme økonomiske og samfunnsmessige konsekvenser rundt om i verden, som ble stadig tydeligere fra den nylige COVID-19-pandemien. Tidlig og nøyaktig diagnose er avgjørende for behandling av virusinfeksjoner samtidig som det forhindrer spredning av virus til friske mennesker. Mens mange virusdeteksjonsmetoder er utviklet, for eksempel PCR-tester1,2 og inmunoassays3, er de fleste av de for tiden brukte metodene ikke i stand til å avgjøre om det oppdagede viruset faktisk er smittsomt eller ikke. Dette skyldes at tilstedeværelsen av komponenter av viruset alene, som viral nukleinsyre eller proteiner, ikke indikerer at det intakte, smittsomme viruset er tilstede, og nivåer av disse biomarkørene har vist dårlig korrelasjon med smittsomhet 4,5,6. For eksempel har viralt RNA, som vanligvis brukes til de nåværende PCR-baserte COVID-19-testene, svært lave nivåer i de tidlige stadiene av infeksjon når pasienten er smittsom, mens RNA-nivået ofte fortsatt er veldig høyt når pasientene har kommet seg etter infeksjonen og ikke lenger er smittsomme 7,8. Det virale proteinet eller antigenbiomarkørene følger en lignende trend, men vises vanligvis enda senere enn det virale RNA og er dermed enda mindre prediktive for smittbarhet 6,9. For å løse denne begrensningen er det utviklet noen metoder som kan informere om virusets smittsomhetsstatus, men er basert på cellekulturmikrobiologiske teknikker som krever lang tid (dager eller uker) for å oppnå resultater 4,10. Dermed kan utvikling av nye sensorer som kan informere om smittbarheten av kliniske eller miljømessige prøver, unngå forsinkelser i behandling og videre spredning av viruset. Imidlertid kan svært få metoder oppnå sensing molekyler som kan gjenkjenne en intakt smittsom virion og skille den fra det samme viruset som har blitt gjort ikke-smittsom.
I denne sammenheng er aptamere spesielt godt egnet som et unikt biomolekylært verktøy11,12,13,14. Aptamerer er korte, enkeltstrengede DNA- eller RNA-molekyler med en spesifikk nukleotidsekvens som lar dem danne en spesifikk 3D-konformasjon for å gjenkjenne et mål med høy affinitet og selektivitet15,16. De oppnås ved en kombinatorisk utvelgelsesprosess kalt systematisk evolusjon av ligander ved eksponentiell anrikning (SELEX), også kjent som in vitro-seleksjon, som utføres i reagensrør med et stort tilfeldig DNA-prøvetakingsbibliotek på 10 14-1015 sekvenser17,18,19. I hver runde av denne iterative prosessen blir DNA-poolen først utsatt for et seleksjonstrykk gjennom inkubasjon med målet under de ønskede forholdene. Eventuelle sekvenser som ikke er bundet til målet blir deretter fjernet, og etterlater bare de få sekvensene som er i stand til å binde under de gitte forholdene. Til slutt forsterkes sekvensene som er valgt i forrige trinn av PCR, beriker befolkningen i bassenget med de ønskede funksjonelle sekvensene for neste valgrunde, og prosessen gjentas. Når aktiviteten til utvalgsbassenget når et platå (vanligvis etter 8-15 runder), analyseres biblioteket ved DNA-sekvensering for å identifisere de vinnende sekvensene som viser høyest affinitet.
SELEX har unike fortrinn som kan utnyttes til å få økt selektivitet mot andre lignende mål20,21, for eksempel for virusets smittsomhetsstatus 22. For det første kan et bredt utvalg av forskjellige typer mål brukes til utvelgelsen, fra små molekyler og proteiner til hele patogener og celler16. For å oppnå en aptamer som binder seg til et smittsomt virus, kan et intakt virus brukes som mål, i stedet for et viralt overflateprotein19. Hele viruset SELEX tillater valg av aptamere som binder seg spesifikt til virusets opprinnelige tilstand uten behov for forstyrrelse av viruset. For det andre kan SELEX skreddersys for å fjerne konkurrerende mål21,23, for eksempel andre lignende virus eller ikke-smittsomme inaktiverte virus, ved hjelp av tellerutvelgelsestrinn i hver runde av utvalg 22. Under tellerutvelgelsestrinnene blir DNA-poolen utsatt for mål som binding ikke er ønskelig for, og eventuelle sekvenser som binder blir forkastet.
I dette arbeidet gir vi en protokoll som generelt kan brukes til å velge aptamere som binder seg til et smittsomt virus, men ikke til det samme viruset som har blitt gjort ikke-smittsomt ved en bestemt desinfeksjonsmetode eller til et annet relatert virus. Denne metoden gjør det mulig å oppnå anerkjennelsesmidler basert på funksjonelle forskjeller i virusoverflaten, som ikke trenger å være kjent på forhånd, og gir derfor en ekstra fordel for påvisning av nylig oppståtte patogener eller for understuderte sykdommer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

Virusinfeksjoner har stor innvirkning på samfunnet; De fleste metoder for påvisning har vanskeligheter med å avgjøre om et påvist virus er smittsomt, noe som forårsaker forsinkelser i behandling og videre spredning av viruset. Utvikling av nye sensorer som kan informere om smittbarheten til kliniske eller miljømessige prøver, vil møte denne uløste utfordringen. Imidlertid kan svært få metoder oppnå sensing molekyler som kan gjenkjenne et intakt smittsomt virus og skille det fra det samme viruset som har blitt gjort ikke-smittsomt ved desinfeksjonsmetoder. Her beskriver vi en protokoll for å velge aptamere som kan skille smittsomme virus vs ikke-smittsomme virus ved systematisk utvikling av ligander ved eksponentiell anrikning (SELEX). Vi drar nytte av to funksjoner i SELEX. For det første kan SELEX skreddersys for å fjerne konkurrerende mål, for eksempel ikke-smittsomme virus eller andre lignende virus, ved hjelp av tellervalg. I tillegg kan hele viruset brukes som mål for SELEX, i stedet for for for eksempel et viralt overflateprotein. Hele viruset SELEX tillater valg av aptamere som binder seg spesifikt til virusets opprinnelige tilstand, uten behov for å forstyrre viruset. Denne metoden gjør det dermed mulig å oppnå anerkjennelsesmidler basert på funksjonelle forskjeller i overflaten av patogener, som ikke trenger å være kjent på forhånd.

Siden DNA-aptamere kan oppnås ved bruk av SELEX i et reagensrør15, ble denne SELEX-strategien nøye utformet for å inkludere både positive seleksjonstrinn mot det intakte, hele smittsomme viruset (dvs. beholde DNA-molekylene som binder seg til det smittsomme viruset), samt motvalgstrinn for det samme viruset som har blitt gjort ikke-smittsomt ved en bestemt desinfeksjonsmetode, nærmere bestemt UV-behandling, ved å forkaste DNA-sekvensene som kan binde seg til det ikke-smittsomme viruset. En...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Vi tilbyr en protokoll som generelt kan brukes til å velge aptamere som binder seg til smittsomme virus og ikke til virus som har blitt gjort ikke-smittsomme ved en desinfeksjonsmetode eller til andre lignende virus. Dette åpner muligheten for å bestemme smittsomhetsstatus i bærbare og raske tester.

In vitro utvalg av aptamere for å skille smittsomme fra ikke-smittsomme virus

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Denne protokollen beskriver hvordan man velger DNA-aptamere som kan skille smittsomme virus versus ikke-smittsomme virus for å oppnå sensing molekyl i stand til å informere smittbarheten av kliniske eller miljømessige prøver. Denne teknikken kan brukes til å oppnå selektive aptamere for mange andre virus, inkludert nye virus, fordi det ikke krever forkunnskaper om virusets strukturer eller sekvenser. Denne teknikken gjør det mulig å utvikle aptamersensorer for klinisk diagnostisk og miljømessig overvåking av smittsomme virus for å oppdage om noen er smittsomme eller om en miljødesinfeksjonsmetode fungerer som tiltenkt.Utvelgelse kan være en vanskelig prosess, spesielt for de som er nye til det. Det er viktig å optimalisere PCR-forholdene og overvåke fremdriften i valget med qPCR. Demonstrere prosedyren vil være Marcos Gramajo, en kandidatstudent fra laboratoriet mitt.For å begynne, design det første enkeltstrengede eller SS-DNA-biblioteket og primere. Få DNA oligos fra kommersielle kilder med standard avsaltingsrensing. Rens SS-DNA-biblioteket og primere på 10% denaturerende polyakrylamidgelelektroforese etterfulgt av etanolutfelling.Deretter får du en stamløsning av smittsomme og ikke-smittsomme virus eller klargjør dem som beskrevet i tekstmanuskriptet. For denaturering av SS-DNA-bibliotek, bland 10 mikroliter 100 mikromolært SS-DNA-bibliotek med 240 mikroliter SELEX-buffer. Varm blandingen ved 95 grader Celsius i 15 minutter i et tørt bad, og legg deretter røret på is i 15 minutter.Bland 250 mikroliter SS-DNA-bibliotek i SELEX-buffer med 50 mikroliter smittsomt virus for positivt utvalg. Inkuber i to timer ved romtemperatur. Deretter tilsettes 400 mikroliter av en millimolar T20-sekvens til et 0,5 milliliters filter for å blokkere de ikke-spesifikke stedene.Inkuber filtrene i 30 minutter. Sentrifuge filteret ved 14.000 g i 10 minutter for å fjerne T20-løsningen. Vask deretter filteret tre ganger med SELEX-buffer for å fjerne overflødige T20-sekvenser.Deretter legger du til SS-DNA-bibliotekets smittsomme virusblanding til det blokkerte 100 kilodalton-filteret og sentrifugen for å vaske ubundne sekvenser. Vask filteret tre ganger ved å tilsette 400 mikroliter SELEX-buffer og sentrifugering. Hold brøkdelen i filteret og kast gjennomstrømningen.For å eluere bundne sekvenser, bytt oppsamlingsrøret til sentrifugefilteret og tilsett 300 mikroliter SELEX-buffer inneholdende åtte molare urea til filteret. Varm filteret ved 95 grader Celsius i 15 minutter, deretter sentrifuge for å samle gjennomstrømningen som inneholder de eluerte sekvensene. Når du er ferdig, vask materialene med 10% blekemiddel.Deretter legger du til SS-DNA-infeksjonsvirusløsningen samlet i det tidligere trinnet til et blokkert 10 kilodaltonfilter, sentrifuge ved 14.000 G i 15 minutter og kaster gjennomstrømningen. Vask filteret tre ganger med 300 mikroliter SELEX-buffer for å fjerne urea ved sentrifugering og kast gjennomstrømningen. Gjenopprett løsningen i filteret ved å snu den opp ned i et rent oppsamlingsrør og sentrifugere i fem minutter.Mål det endelige volumet av den gjenvunnede oppløsningen ved hjelp av en pipette og merk den som en prøve av runde 1A. Ta 90% av Round 1A-prøven som en mal i første runde og kjør PCR ved hjelp av optimaliserte forhold. For å gjenopprette SS-DNA ved hjelp av streptavidin modifiserte magnetiske perler eller MB, del produktet i 50 mikroliter alikoter og legg dem til mikrosentrifugerør som inneholder 50 mikroliter MB. Inkuber røret i 30 minutter med mild omrøring ved romtemperatur.Plasser deretter røret på magnetstativet for å isolere MB og fjern supernatanten ved pipettering. Vask MB to ganger ved å legge 200 mikroliter bindings- og vaskebuffer til røret. Fjern deretter røret fra magnetstativet og bank på det før du resuspenderer MB til en homogen løsning ved pipettering.Plasser røret igjen på magnetstativet og fjern supernatanten. Etter den andre vasken, resuspender MB i 100 mikroliter SELEX-buffer og varm oppløsningen ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Plasser umiddelbart røret i magnetstativet og samle supernatanten som inneholder SS-DNA-bassenget.Gjenta dette gjenopprettingstrinnet og legg til 50 mikroliter SELEX-buffer. Mål det endelige volumet av den gjenvunnede fraksjonen og merk den som runde 1X. For denaturering av SS-DNA-bassenget, ta 60% av Round 1X-prøven og bland den med 50 mikroliter SELEX-buffer.Varm prøven i et tørt bad, og legg deretter røret på is i 15 minutter. Bland deretter det denaturerte SS-DNA-bassenget i SELEX-buffer med 50 mikroliter av hvert virus som motvalgstrinn og inkuber i en time ved romtemperatur. Etter å ha blokkert de ikke-spesifikke stedene i sentrifugefiltre, tilsett blandingen denaturert SS-DNA-basseng inkubert med en virusløsning til et blokkert 100 kilodaltonfilter.Sentrifuge filteret ved 14.000 G i 10 minutter og samle gjennomstrømningen. Ta 300 mikroliter fraksjon og bland med 50 mikroliter smittsomt virus som inneholder 100 millioner eksemplarer per milliliter. Inkuber i to timer ved romtemperatur.Forbered en standard qPCR-masterblanding og fortynninger av renset SS-DNA-bibliotek som beskrevet i teksten. Kjør qPCR for å bestemme terskelsyklusen. Etter kjøringen, bruk en standardkurve for å kvantifisere mengden SS-DNA i runde 1A og runde 1X.Beregn deretter elueringsutbyttet som den bundne DNA-mengden delt på den opprinnelige DNA-mengden og plott elueringsutbyttet mot det runde tallet. Til slutt plotter du smeltekurvene for forskjellige runder. For sekvensering med høy gjennomstrømning velger du et passende kommersielt tilgjengelig sett.Forbered flere puljer med utvalgsrunder som representerer høy, middels og lav berikelse, samt den endelige puljen ved hjelp av forskjellige indekspar i adapterne for hver pulje. Send deretter det forberedte endelige biblioteket til sekvenseringsanlegget. For sekvenseringsanalyse har sekvensene blitt de-multiplekset av sekvenseringsanlegget.Fjern sekvenseringsadaptere og utvalgsprimere ved hjelp av kommandolinjeprogrammet Cutadapt. Bruk deretter FASTX-Toolkit-programmet til å fjerne sekvenser av lav kvalitet. Slå deretter sammen sekvensfilene i motsatt retning med de i fremoverretningen ved hjelp av FASTX-Toolkit-FASTX_reverse_ komplementfunksjonen på motsatt retningsfiler.Bruk deretter det innebygde CAT-programmet til å slå sammen filene til en enkelt fil. Bruk FASTAptamer analyseverktøysett til å analysere suppleringen av sekvenser på tvers av ulike utvalgsutvalg. Først for å bruke funksjonene FASTAptamer count og FASTAptamer cluster til å gruppere lignende sekvenser i klynger.Deretter bruker du FASTAptamer berik-funksjonen for å få informasjon om berikelse av sekvenser og klynger. Identifiser kandidataptamersekvensene fra anrikningsinformasjonen oppnådd gjennom sekvensanalyse. Velg flere aptamer-sekvenser og utfør innledende screening ved hjelp av en bindingsanalyse.I denne analysen ble qPCR brukt til å overvåke fremdriften av SELEX av smittsomme SARS-CoV-2-spesifikke aptamere. Elusjonsutbyttet økte i utgangspunktet med hver runde av SELEX og flatet ut i runde åtte og ni. Ved å sammenligne smeltekurvene ble det observert et skifte fra toppen ved høy smeltetemperatur fra 77 til 79 grader Celsius.Videre ble det i de to siste rundene observert en topp ved lav smeltetemperatur. Den relative overfloden i avlesninger per million for den sekvenserte SARS2 AR10 oppnådd over påfølgende utvalgsrunder vises. Den forutsagte strukturen til SARS2 AR10 viste en strukturert sekundærstruktur som inneholdt en stammesløyferegion som kan være involvert i å gjenkjenne viruset.Når aptamere er oppnådd, kan de innlemmes i elektriske optiske, en annen type sensorer, for å utvikle portal og rask virusdeteksjonstest som kan informere virussmittsomhet. Vi ser for oss at man kan få aptamer som er spesifikke for ulike varianter eller stereotyper av virus, noe som gjør det mulig for rask overvåking av varianter som er den største trusselen mot samfunnet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisere Proteiner og makromolekylær komplekser ved Negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utnyttelse av mikro Silicon Cantilevers å vurdere Cellular kontraktile funksjon<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Utvikling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform til Test kontaktlinser

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Syntese av smittsomme Bacteriophages i en E. coli -basert Cell-free uttrykk System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avanserte 3D levermodeller for in vitro gentoksisitetstesting etter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...