Name: in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

Bu protokolde kullanılan psödovirüs örneklerini (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1) sağladıkları için Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nden Bayan Laura M. Cooper ve Dr. Lijun Rong'a ve ayrıca Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi'ndeki Roy J. Carver Biyoteknoloji Merkezi'nin DNA Hizmetleri tesisinden Dr. Alvaro Hernandez ve Dr. Chris Wright'a yüksek verimli dizileme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. ve in vitro seleksiyon ve aptamer karakterizasyon tekniklerinde bize yardımcı olan Lu grubunun birçok üyesi. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı'ndan (CBET 20-29215) bir RAPID hibesi ve Urbana-Champaign ve Illinois-JITRI Enstitüsü'ndeki Illinois Üniversitesi Sürdürülebilirlik, Enerji ve Çevre Enstitüsü'nden (JITRI 23965) bir tohum hibesi ile desteklenmiştir. A.S.P., finansal desteği için PEW Latin Amerika Bursu'na teşekkür eder. Ayrıca, Austin'deki Teksas Üniversitesi'ndeki Lu grubu araştırma programına destek için Robert A. Welch Vakfı'na (Grant F-0020) teşekkür ederiz.

1. Reaktiflerin ve tamponların hazırlanması
<ol><li>1 L'lik son hacme 0,9 M Tris-baz, 0,9 M borik asit, 20 mM EDTA (disodyum tuzu) ve deiyonize su ekleyerek 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) hazırlayın.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi% 10 denatüre edici bir poliakrilamid stok çözeltisi hazırlayın. 250 mL'lik bir cam şişede, 120 g üre (8 M), 25 mL 10x TBE, 62.5 mL% 40 akrilamid / bisakrilamid (29: 1) çözeltisi ve 250 mL'lik nihai hacme ulaşmak için yeterli damıtılmış su ekleyin. Tüm bileş...

SELEX, sadece pM-nM 22,43,44,45 aralığında yüksek afiniteli aptamerlerin tanımlanmasına değil, aynı zamanda yüksek ve ayarlanabilir seçiciliğe sahip aptamerlerin tanımlanmasına da izin verir. Sayaç seçiminden yararlanılarak, zorlu seçiciliğe sahip aptamerler elde edilebilir. Örneğin, Li grubu, patojenik bakteri suşlarını patojenik olmayan suşlardan ayırt edebilen dizil...

Virüs enfeksiyonlarının, son COVID-19 pandemisinden itibaren giderek daha belirgin hale geldiği gibi, dünya çapında muazzam ekonomik ve toplumsal etkileri vardır. Zamanında ve doğru tanı, virüslerin sağlıklı insanlara yayılmasını önlerken viral enfeksiyonların tedavisinde çok önemlidir. PCR testleri 1,2 ve inmunoassay3 gibi birçok virüs tespit yöntemi geliştirilmiş olsa da, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, tespit edilen virüsün gerçekten bulaşıcı olup olmadığını belirleyememektedir. Bunun nedeni, viral nükleik asit veya proteinler gibi tek başına virüsün bileşenlerinin varlığının, sağlam, bulaşıcı virüsün mevcut olduğunu göstermemesi ve bu biyobelirteçlerin seviyelerinin bulaşıcılıkile zayıf korelasyon göstermesidir 4,5,6. Örneğin, mevcut PCR tabanlı COVID-19 testleri için yaygın olarak kullanılan viral RNA, hasta bulaşıcı olduğunda enfeksiyonun erken evrelerinde çok düşük seviyelere sahipken, hastalar enfeksiyondan iyileştiğinde ve artık bulaşıcı olmadığında RNA seviyesi genellikle hala çok yüksektir 7,8. Viral protein veya antijen biyobelirteçleri benzer bir eğilimi takip eder, ancak tipik olarak viral RNA'dan daha sonra ortaya çıkar ve bu nedenle bulaşıcılığın daha az öngörücüsüdür 6,9. Bu sınırlamayı ele almak için, virüsün bulaşıcılık durumu hakkında bilgi verebilecek bazı yöntemler geliştirilmiştir, ancak sonuç elde etmek için uzun zaman (günler veya haftalar) gerektiren hücre kültürü mikrobiyoloji tekniklerine dayanmaktadır 4,10. Bu nedenle, klinik veya çevresel örneklerin bulaşıcılığı hakkında bilgi verebilecek yeni sensörler geliştirmek, tedavideki gecikmeleri ve virüsün daha fazla yayılmasını önleyebilir. Bununla birlikte, çok az yöntem, bozulmamış bir enfeksiyöz viryonu tanıyabilen ve onu bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüsten ayırt edebilen algılama molekülleri elde edebilir.
Bu bağlamda, aptamerler benzersiz bir biyomoleküler araç olarak özellikle uygundur11,12,13,14. Aptamerler, yüksek afinite ve seçiciliğe sahip bir hedefi tanımak için spesifik bir 3D konformasyon oluşturmalarını sağlayan spesifik bir nükleotid dizisine sahip kısa, tek sarmallı DNA veya RNA molekülleridir15,16. İn vitro seleksiyon olarak da bilinen üstel zenginleştirme (SELEX) ile ligandların sistematik evrimi adı verilen ve 10 14-1015 dizili 17,18,19 büyük bir rastgele DNA örnekleme kütüphanesine sahip test tüplerinde gerçekleştirilen kombinatoryal bir seçim süreci ile elde edilirler. Bu yinelemeli işlemin her turunda, DNA havuzu ilk önce istenen koşullar altında hedefle inkübasyon yoluyla bir seçim baskısına tabi tutulur. Hedefe bağlı olmayan tüm diziler daha sonra kaldırılır ve geride yalnızca verilen koşullar altında bağlanabilen birkaç dizi kalır. Son olarak, önceki adımda seçilen diziler PCR ile güçlendirilir, havuzun popülasyonu bir sonraki seçim turu için istenen fonksiyonel dizilerle zenginleştirilir ve işlem tekrarlanır. Seçim havuzunun aktivitesi bir platoya ulaştığında (tipik olarak 8-15 turdan sonra), kütüphane en yüksek afiniteyi sergileyen kazanan dizileri tanımlamak için DNA dizilimi ile analiz edilir.
SELEX, virüsün bulaşıcılık durumu 22 gibi diğer benzer hedeflere karşı daha fazla seçicilik kazanmak için kullanılabilecek benzersiz avantajlara sahiptir20,21. İlk olarak, seçim için küçük moleküllerden ve proteinlerden tüm patojenlere ve hücrelere kadar çok çeşitli farklı tipte hedefler kullanılabilir16. Böylece, bulaşıcı bir virüse bağlanan bir aptamer elde etmek için, viral bir yüzey proteini19 yerine, sağlam bir virüs hedef olarak kullanılabilir. Bütün virüs SELEX, virüsün bozulmasına gerek kalmadan, özellikle virüsün doğal durumuna bağlanan aptamerlerin seçilmesine izin verir. İkincisi, SELEX, diğer benzer virüsler veya bulaşıcı olmayan inaktive virüsler gibi rakip hedefleri 21,23'ü kaldırmak için özel olarak hazırlanabilirve her seçim 22 turunda karşı seçim adımları kullanılabilir. Karşı seçim adımları sırasında, DNA havuzu bağlanma istenmeyen hedeflere maruz bırakılır ve bağlanan diziler atılır.
Bu çalışmada, bulaşıcı bir virüse bağlanan, ancak belirli bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüse veya başka bir ilgili virüse bağlanmayan aptamerleri seçmek için genel olarak uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, önceden bilinmesi gerekmeyen virüs yüzeyinin fonksiyonel farklılıklarına dayanarak tanıma ajanlarının elde edilmesini sağlar ve böylece yeni ortaya çıkan patojenlerin tespiti veya az çalışılmış hastalıklar için ek bir avantaj sunar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA clean-up beads - Section 7.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td>cut-off 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>cut-off 100 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X p24 Rapid Titer Kit</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc.</td>
			<td>632200</td>
			<td>Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>non-UV absorbing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MLP9611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td>New England BioLab</td>
			<td>M0480S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>0344NB-A01</td>
			<td>High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN G (100-1000 &#181;L, 20-200 &#181;L, 2-20 &#181;L and 0.2-2 &#181;L)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>fluorescence-based&#160; dsDNA quantification&#160; kit - Section 7.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725201</td>
			<td>qPCR mastermix - Section 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>AB1183</td>
			<td>PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro selection of aptamers to differentiate infectious from non-infectious viruses

Virüs enfeksiyonlarının toplum üzerinde büyük bir etkisi vardır; Çoğu tespit yöntemi, tespit edilen bir virüsün bulaşıcı olup olmadığını belirlemede zorluk çeker, bu da tedavide gecikmelere ve virüsün daha da yayılmasına neden olur. Klinik veya çevresel numunelerin bulaşıcılığı hakkında bilgi verebilecek yeni sensörler geliştirmek, bu karşılanmamış zorluğun üstesinden gelecektir. Bununla birlikte, çok az yöntem, bozulmamış bir bulaşıcı virüsü tanıyabilen ve dezenfeksiyon yöntemleriyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüsten ayırt edebilen algılama molekülleri elde edebilir. Burada, üstel zenginleştirme (SELEX) ile ligandların sistematik evrimini kullanarak bulaşıcı virüsleri ve bulaşıcı olmayan virüsleri ayırt edebilen aptamerleri seçmek için bir protokol açıklıyoruz. SELEX'in iki özelliğinden yararlanıyoruz. İlk olarak, SELEX, sayaç seçimi kullanılarak bulaşıcı olmayan virüsler veya diğer benzer virüsler gibi rakip hedefleri kaldırmak için özel olarak hazırlanabilir. Ek olarak, tüm virüs, örneğin viral bir yüzey proteini yerine, SELEX'in hedefi olarak kullanılabilir. Bütün virüs SELEX, virüsün bozulmasına gerek kalmadan, özellikle virüsün doğal durumuna bağlanan aptamerlerin seçilmesine izin verir. Bu yöntem, patojenlerin yüzeyindeki fonksiyonel farklılıklara dayanarak önceden bilinmesi gerekmeyen tanıma ajanlarının elde edilmesini sağlar.

DNA aptamerleri bir test tüpü15'te SELEX kullanılarak elde edilebildiğinden, bu SELEX stratejisi, hem sağlam, tüm enfeksiyöz virüse doğru pozitif seleksiyon adımlarını (yani, bulaşıcı virüse bağlanan DNA moleküllerini tutmak) hem de belirli bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüs için karşı seçim adımlarını içerecek şekilde dikkatlice tasarlanmıştır. Özellikle UV tedavisi, bulaşıcı olmayan virüse bağlanabilen DNA dizilerini...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses at JoVE.com

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Genel olarak, bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilmiş virüslere veya diğer benzer virüslere değil, yalnızca bulaşıcı virüslere bağlanan belirli aptamerlere uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu, taşınabilir ve hızlı testlerde bulaşıcılık durumunu belirleme olasılığını açar.

Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Bu protokol, klinik veya çevresel örneklerin bulaşıcılığını bildirebilecek algılama molekülü elde etmek için bulaşıcı virüsleri bulaşıcı olmayan virüslere karşı ayırt edebilen DNA aptamerlerinin nasıl seçileceğini açıklar. Bu teknik, ortaya çıkan virüsler de dahil olmak üzere diğer birçok virüs için seçici aptamerler elde etmek için uygulanabilir, çünkü virüsün yapıları veya dizileri hakkında önceden bilgi gerektirmez. Bu teknik, birinin bulaşıcı olup olmadığını veya çevresel bir dezenfeksiyon yönteminin amaçlandığı gibi çalışıp çalışmadığını tespit etmek için bulaşıcı virüslerin klinik teşhisi ve çevresel izlenmesi için aptamer sensörlerinin geliştirilmesine izin verir.Seçim, özellikle yeni olanlar için zor bir süreç olabilir. PCR koşullarını optimize etmek ve qPCR ile seçimin ilerlemesini izlemek önemlidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Marcos Gramajo olacak.Başlamak için, ilk tek sarmallı veya SS-DNA kütüphanesini ve primerlerini tasarlayın. DNA oligolarını standart tuzdan arındırma saflaştırma ile ticari kaynaklardan elde edin. SS-DNA kütüphanesini ve primerleri% 10 denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezi ve ardından etanol çökeltmesi ile saflaştırın.Daha sonra, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virüslerin stok çözeltisini elde edin veya bunları metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın. SS-DNA kütüphanesinin denatürasyonu için, 10 mikrolitre 100 mikromolar SS-DNA kütüphanesini 240 mikrolitre SELEX tamponu ile karıştırın. Karışımı kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın, ardından tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.Pozitif seleksiyon için 250 mikrolitre SS-DNA kütüphanesini SELEX tamponunda 50 mikrolitre bulaşıcı virüs ile karıştırın. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ardından, spesifik olmayan bölgeleri engellemek için 0,5 mililitrelik bir filtreye bir milimolar T20 dizisinin 400 mikrolitresini ekleyin.Filtreleri 30 dakika boyunca inkübe edin. T20 çözeltisini çıkarmak için filtreyi 14.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, fazla T20 dizilerini gidermek için filtreyi SELEX tamponu ile üç kez yıkayın.Ardından, SS-DNA kütüphanesi enfeksiyöz virüs karışımını bloke edilmiş 100 kilodalton filtreye ve bağlanmamış dizileri yıkamak için santrifüje ekleyin. 400 mikrolitre SELEX tamponu ve santrifüjleme ekleyerek filtreyi üç kez yıkayın. Kesiri filtrede tutun ve akışı atın.Bağlı dizileri elde etmek için, santrifüj filtresinin toplama tüpünü değiştirin ve filtreye sekiz molar üre içeren 300 mikrolitre SELEX tamponu ekleyin. Filtreyi 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın, ardından salınan dizileri içeren akışı toplamak için santrifüj yapın. İşiniz bittiğinde, malzemeleri% 10 ağartıcı ile yıkayın.Daha sonra, önceki adımda toplanan SS-DNA bulaşıcı virüs çözeltisini bloke edilmiş 10 kilodalton filtreye ekleyin, 15 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüj yapın ve akışı atın. Üreyi santrifüjleme ile çıkarmak ve akışı atmak için filtreyi 300 mikrolitre SELEX tamponu ile üç kez yıkayın. Filtredeki çözeltiyi temiz bir toplama tüpünde baş aşağı çevirerek ve beş dakika boyunca santrifüj yaparak geri kazanın.Bir pipet kullanarak geri kazanılan çözeltinin son hacmini ölçün ve Round 1A numune olarak etiketleyin. İlk turda Round 1A örneğinin %90'ını şablon olarak alın ve optimize edilmiş koşulları kullanarak PCR'yi çalıştırın. Streptavidin modifiye manyetik boncuklar veya MB kullanarak SS-DNA'yı kurtarmak için, ürünü 50 mikrolitre alikotlara bölün ve bunları 50 mikrolitre MB içeren mikrosantrifüj tüplerine ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında hafif ajitasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, MB'yi izole etmek ve süpernatantı pipetleme ile çıkarmak için tüpü manyetik rafa yerleştirin. Tüpe 200 mikrolitre bağlama ve yıkama tamponu ekleyerek MB'yi iki kez yıkayın. Ardından tüpü manyetik raftan çıkarın ve MB'yi pipetleme yoluyla homojen bir çözeltiye yeniden askıya almadan önce tüpe dokunun.Tüpü tekrar manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. İkinci yıkamadan sonra, MB'yi 100 mikrolitre SELEX tamponunda tekrar askıya alın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Tüpü hemen manyetik rafa yerleştirin ve SS-DNA havuzunu içeren süpernatantı toplayın.50 mikrolitre SELEX tamponu ekleyerek bu kurtarma adımını tekrarlayın. Geri kazanılan fraksiyonun son hacmini ölçün ve Yuvarlak 1X olarak etiketleyin. SS-DNA havuzunun denatürasyonu için, Round 1X numunesinin% 60'ını alın ve 50 mikrolitre SELEX tamponu ile karıştırın.Numuneyi kuru bir banyoda ısıtın, ardından tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, denatüre SS-DNA havuzunu SELEX tamponunda karşı seçim adımı olarak her virüsün 50 mikrolitresi ile karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Santrifüj filtrelerinde spesifik olmayan bölgeleri bloke ettikten sonra, bir virüs çözeltisi ile inkübe edilmiş karışım denatüre SS-DNA havuzunu bloke edilmiş 100 kilodalton filtreye ekleyin.Filtreyi 14.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve akışı toplayın. 300 mikrolitre fraksiyon alın ve mililitre başına 100 milyon kopya içeren 50 mikrolitre bulaşıcı virüs ile karıştırın. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.Standart bir qPCR ana karışımı ve metinde açıklandığı gibi saflaştırılmış SS-DNA kütüphanesinin seyreltmelerini hazırlayın. Eşik döngüsünü belirlemek için qPCR'yi çalıştırın. Koşudan sonra, Round 1A ve Round 1X'teki SS-DNA miktarını ölçmek için standart bir eğri kullanın.Daha sonra elüsyon verimini, bağlı DNA miktarının ilk DNA miktarına bölünmesiyle hesaplayın ve elüsyon verimini yuvarlak sayıya karşı çizin. Son olarak, farklı turlar için erime eğrilerini çizin. Yüksek verimli sıralama için, piyasada bulunan uygun bir kit seçin.Yüksek, orta ve düşük zenginleştirmeyi temsil eden birden fazla seçim turu havuzunun yanı sıra her havuz için bağdaştırıcılarda farklı bir dizin çifti kullanarak son havuzu hazırlayın. Daha sonra hazırlanan son kütüphaneyi sıralama tesisine gönderin. Sıralama analizi için, diziler sıralama tesisi tarafından çoğuldan arındırılmıştır.Cutadapt komut satırı programını kullanarak sıralama bağdaştırıcılarını ve seçim astarlarını çıkarın. Ardından, düşük kaliteli dizileri kaldırmak için FASTX-Toolkit programını kullanın. Ardından, ters yön dosyalarındaki FASTX-Araç Seti FASTX_reverse_ tamamlama işlevini kullanarak sıra dosyalarını ters yöndekilerle birleştirin.Ardından, dosyaları tek bir dosyada birleştirmek için yerleşik CAT programını kullanın. Farklı seçim havuzlarındaki dizilerin zenginleştirilmesini analiz etmek için FASTAptamer analiz araç setini kullanın. İlk olarak, benzer dizileri kümeler halinde gruplandırmak için FASTAptamer sayısı ve FASTAptamer küme işlevlerini kullanmak.Ardından, dizilerin ve kümelerin zenginleştirilmesi hakkında bilgi almak için FASTAptamer zenginleştirme işlevini kullanın. Dizi analizi yoluyla elde edilen zenginleştirme bilgilerinden aday aptamer dizilerini tanımlayın. Birkaç aptamer dizisi seçin ve bir bağlama testi kullanarak ilk taramayı gerçekleştirin.Bu analizde, enfeksiyöz SARS-CoV-2 spesifik aptamerlerinin SELEX'inin ilerlemesini izlemek için qPCR kullanılmıştır. Elüsyon verimi başlangıçta her SELEX turunda arttı ve sekizinci ve dokuzuncu turlarda seviyelendirildi. Erime eğrilerini karşılaştırarak, 77 ila 79 santigrat derece arasında yüksek bir erime sıcaklığında zirveden bir kayma gözlendi.Dahası, son iki turda, düşük erime sıcaklığında bir tepe gözlendi. Ardışık seçim turlarında elde edilen sıralı SARS2 AR10 için milyonda okumalardaki göreceli bolluk gösterilmiştir. SARS2 AR10'un öngörülen yapısı, virüsün tanınmasında rol oynayabilecek bir kök döngü bölgesi içeren yapılandırılmış bir ikincil yapı gösterdi.Aptamerler elde edildikten sonra, virüs bulaşıcılığını bildirebilecek portal ve hızlı virüs tespit testi geliştirmek için başka bir sensör türü olan elektriksel optiklere dahil edilebilirler. Farklı varyantlara veya virüs klişelerine özgü aptamerlerin elde edilebileceğini ve toplum için en büyük tehdit olan varyantların hızlı bir şekilde izlenmesini mümkün kılacağını öngörüyoruz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Mikro Silikon konsolun Kullanımı Hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için<em&gt; İn Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Göz Platformu Lensler Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...