Cette technique utilise l’imagerie TEP pour élucider la distribution et la dynamique in vivo des lymphocytes B dans le système nerveux central. Notre approche est bénéfique pour l’étude des maladies neurologiques, où la moelle épinière affectée rend l’analyse plus difficile. Il y a donc quelques avantages principaux à notre technique.
Tout d’abord, nous avons créé un nouvel outil pour suivre un biomarqueur pan de cellules B qui nous permet de capturer une gamme de sous-ensembles de cellules B et de les visualiser in vivo. Deuxièmement, notre méthode d’analyse de la moelle épinière permet une quantification très précise et reproductible des signaux TEP dans cette région. Ce qu’il y a de bien avec notre technique, c’est qu’elle est indépendante de la maladie.
Il peut être utilisé de l’imagerie TEP préclinique à clinique dans n’importe quel scénario, où les cellules B et/ou la moelle épinière sont d’intérêt. 18 à 24 heures après le radiomarquage et l’injection de l’anticorps dans la souris, préparez la souris pour le balayage en appliquant un gel oculaire sur les yeux. Assurez-vous que le lit de numérisation pour quatre souris est équipé d’un coussin chauffant avec de l’isoflurane réglé de 1,5 à 2 %Placez la souris en position couchée sur le dos sur le lit de numérisation et tirez doucement sur la queue de la souris pour redresser la colonne vertébrale.
Une fois que la souris est en position couchée sur le dos, collez-la solidement avec du ruban adhésif souple sur la tête et le ventre pour minimiser le mouvement de la respiration. Notez la position de numérisation de chaque souris dans un cahier de laboratoire. Après avoir sécurisé le premier groupe, fermez le lit et vérifiez l’emplacement du lit en exécutant une tomodensitométrie.
Cliquez sur Champ de vision central de la tomodensitométrie, et une fois que le lit est en position, exécutez le test de tomodensitométrie pour vous assurer que le placement est correct. Répétez l’opération jusqu’à ce que la position du lit soit satisfaisante. Placez un petit ruban adhésif blanc sur le lit du scanner pour marquer l’emplacement correct du lit pour le reste de l’étude.
Ouvrez le menu Motion Controller et cliquez sur Champ de vision du centre PET pour déplacer les souris dans l’anneau PET. Une fois que le lit est dans l’anneau TEP, lancez la séquence de balayage en cliquant sur Exécuter, et attendez que le scanner termine automatiquement le TEP, puis passez de l’anneau TEP à la tomodensitométrie pour l’acquisition de la tomographie par émission de positons. Étant donné que les souris expérimentales ont une courbure prononcée de la colonne vertébrale en raison de la progression de la maladie, les scanner sur le dos aide à redresser la colonne vertébrale.
Faites une incision sur la face dorsale de l’animal et retirez la peau et la fourrure pour exposer la colonne vertébrale. Coupez le long de trois plans transversaux à travers la colonne vertébrale au niveau du cou, directement sous la cage thoracique et au sommet du bassin pour séparer les régions lombaires des régions cervicales et thoraciques. Retirez délicatement la colonne vertébrale segmentée pour obtenir deux morceaux, lombaire et cervical thoracique.
Isolez ensuite la colonne vertébrale lombaire en coupant soigneusement la colonne vertébrale de l’extrémité pelvienne jusqu’à ce que la moelle épinière lombaire soit visible. Pour expulser la moelle épinière lombaire, utilisez une seringue à embout coulissant remplie de PBS et créez un joint entre la seringue et la colonne vertébrale à l’aide du pouce et de l’index. Poussez doucement le PBS à travers la seringue pour expulser la moelle épinière sur un tampon absorbant, et répétez l’opération pour la moelle épinière cervicale thoracique en insérant la seringue du côté cervical.
Placez les tissus de la moelle épinière dans un tube de comptage gamma. Enregistrez le poids sec et ajoutez du PBS pour vous assurer que le tissu est au fond du tube pour éviter qu’il ne se dessèche. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à compter.
Pour commencer l’analyse des régions d’intérêt de la moelle épinière, ouvrez l’outil Région d’intérêt 3D dans le menu de navigation. Sous l’en-tête Régions d’intérêt, utilisez le signe plus en bas du menu pour créer six régions d’intérêt, région lombaire d’intérêt, région thoracique cervicale d’intérêt, squelette lombaire, squelette thoracique, moelle épinière lombaire, moelle épinière thoracique. Pour éviter les interférences visuelles du signal PET, cliquez sur F3 pour désactiver le PET.
Allez en haut de l’opérateur de l’outil Région d’intérêt 3D et cliquez sur le point plein à droite du symbole du curseur pour ouvrir le mode Peinture 3D et le menu Éroder/Dilater. Sélectionnez Sphère et définissez la taille sur 20 pixels. De même, réglez dilate à plus cinq.
Avant d’aller plus loin, allez au bas du menu et assurez-vous que la région lombaire qui vous intéresse est sélectionnée. Sur le scanner, trouvez la vertèbre L6 de la colonne vertébrale. En commençant par une vertèbre au-dessus de L6, dessinez une région lombaire rugueuse d’intérêt sur les cinq vertèbres au-dessus des hanches.
Ensuite, passez à la région thoracique cervicale d’intérêt et tracez le reste de la colonne vertébrale jusqu’à la base du crâne. Après avoir dessiné les régions d’intérêt généralisées, allez en haut de l’opérateur et sélectionnez le menu Algorithmes de segmentation. Dans le menu déroulant, sélectionnez Otsu Thresholding, puis sélectionnez la région lombaire d’intérêt pour l’entrée, et assurez-vous que le squelette lombaire est choisi en bas du menu.
Dans le menu déroulant à côté de Image, assurez-vous que la tomodensitométrie est sélectionnée, indiquée ici par le chiffre zéro. Cliquez sur Appliquer et répétez la procédure pour la région thoracique cervicale d’intérêt et le squelette thoracique. Après avoir utilisé le seuillage Otsu pour créer les régions squelettiques qui vous intéressent, revenez au menu Navigation et supprimez la région d’intérêt, ou cochez la colonne H pour les régions lombaires et cervicales thoraciques d’intérêt afin de les masquer.
Cochez la colonne I pour les deux régions squelettiques d’intérêt, afin qu’elles ne puissent pas être modifiées. Enfin, revenez en haut de l’opérateur de l’outil Région d’intérêt 3D et accédez au menu Peinture 3D pour dessiner les régions de la moelle épinière qui vous intéressent. Sélectionnez à nouveau l’outil Sphère et tracez la moelle épinière dans le squelette pour les lombaires et les thoraciques, en veillant à ce que la bonne région d’intérêt soit sélectionnée en bas du menu.
Pour effacer une zone d’intérêt, cliquez sur Commande/Contrôle et dessinez sur la partie à effacer. Vérifiez la région de la moelle épinière d’intérêt à partir des trois plans pour vous assurer qu’aucune région d’intérêt n’est dessinée à l’extérieur de la colonne vertébrale. Si le signal PET a été désactivé, appuyez sur F3 après que les régions de la moelle épinière d’intérêt ont été dessinées pour réactiver le TEP, ou sélectionnez le contrôleur visuel, puis cliquez sur la barre PET.
Revenez au menu de navigation. Cliquez sur l’icône Grille pour afficher le tableau. Copiez le tableau dans un tableur et enregistrez le fichier.
L’imagerie TEP a révélé une liaison élevée des radiotraceurs dans le cerveau et la moelle épinière thoracique des souris EAE par rapport aux souris naïves. Le comptage gamma ex vivo a montré une liaison accrue dans les segments rachidiens thoraciques lombaires et cervicaux, et dans le cerveau des souris EAE par rapport aux souris naïves. Les images d’autoradiographie ex vivo ont montré une augmentation de la liaison des radiotraceurs dans les sections cérébrales sagittales, en particulier dans le tronc cérébral, le cervelet et les ventricules des souris EAE par rapport aux souris naïves.
De même, une augmentation de la liaison des radiotraceurs a été observée dans les segments de la moelle épinière cervicale, thoracique et lombaire des souris EAE par rapport aux moelles épinières naïves. Après l’imagerie TEP et le comptage gamma, nous pouvons étudier la relation entre le signal TEP et la cible d’intérêt grâce à des techniques de biologie moléculaire, telles que la cytométrie en flux et l’immunohistochimie. Notre technique a ouvert la voie aux chercheurs pour poser des questions sur le rôle in vivo des lymphocytes B dans de multiples domaines pathologiques, notamment les accidents vasculaires cérébraux, la sclérose en plaques, d’autres maladies auto-immunes et le cancer.
