Name: essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل منحة تطوير أعضاء هيئة التدريس لصندوق الاستثمار الاستراتيجي للعلوم الصحية بجامعة كريتون. تم توفير سلالة B. burgdorferi RpoC-His10X من قبل الدكتور د. سكوت صامويلز من جامعة مونتانا. تم توفير سلالة الإشريكية القولونية التي تؤوي بلازميد pMAL-C5X الذي يشفر أليل rpoD المرتبط بالبروتين المرتبط بالمالتوز من قبل الدكتور فرانك غيرارديني من مختبرات روكي ماونتن ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.

1. تنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي وإعداد مخزون بوليميراز الحمض النووي الريبي
<ol><li>اجمع حبيبات الخلية من 2-4 لتر من B. burgdorferi RpoC-His10X المستزرعة في وسط BSKII في بيئة محبة للهواء (34 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O 2) إلى كثافة2-4 × 107 خلايا / مل باستخدام بروتوكولات جمع الخلايا المو...

<ol>
	<li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li><li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness.">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li><li>Cutler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapsing+fever+Borreliae:+A+global+review.">Relapsing fever Borreliae: A global review.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).</li><li>Barbour, A. G., Hayes, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Borrelia+species.">Biology of Borrelia species.</a> Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).</li><li>Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+infection+with+Borrelia+burgdorferi.">Biology of infection with Borrelia burgdorferi.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+Lyme+disease+spirochete+with+its+tick+vector.">Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).</li><li>Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weak+organic+acids+decrease+Borrelia+burgdorferi+cytoplasmic+pH,+eliciting+an+acid+stress+response+and+impacting+RpoN-+and+RpoS-dependent+gene+expression.">Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).</li><li>Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+virulence-related+regulatory+pathways+in+Borrelia+burgdorferi+are+directly+affected+by+osmotic+fluxes+in+the+blood+meal+of+feeding+ixodes+ticks.">Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).</li><li>Bugrysheva, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+RelBbu+Regulon+in+Borrelia+burgdorferi+reveals+modulation+of+glycerol+metabolism+by+(p)ppGpp.">Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp.</a> PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).</li><li>Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+pH+on+membrane+proteins+in+Borrelia+burgdorferi.">Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Borrelia+burgdorferi+RelA/SpoT+homolog+and+stringent+response+regulate+survival+in+the+tick+vector+and+global+gene+expression+during+starvation.">The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation.</a> PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).</li><li>Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels.">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li><li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi.">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li><li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+levels+alter+gene+expression+and+antigen+profiles+in+Borrelia+burgdorferi.">Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).</li><li>Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+differential+expression+of+antigens+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).</li><li>Troxell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+and+zinc+regulate+virulence+determinants+in+Borrelia+burgdorferi.">Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+environmental+factors+influencing+reciprocal+patterns+of+gene+expression+in+virulent+Borrelia+burgdorferi.">Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi.</a> Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).</li><li>Samuels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+and+transcriptomics.">Gene regulation and transcriptomics.</a> Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).</li><li>Fraser, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequence+of+a+Lyme+disease+spirochaete,+Borrelia+burgdorferi.">Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi.</a> Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).</li><li>Iyer, R., Schwartz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+comparative+genomic+and+transcriptome+analysis+of+Borrelia+burgdorferi.">Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi.</a> Microarrays. 5 (2), 9 (2016).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+global+alterations+in+the+transcriptomes+of+Lyme+disease+spirochetes+during+tick+feeding+and+following+mammalian+host+adaptation.">Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation.</a> Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity.">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system:+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi.">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).</li><li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors.">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li><li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase:+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements.">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRENDA,+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021:+New+developments+and+updates.">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li><li>Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+and+complementation.">Genetic transformation and complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).</li><li>Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetic transformation of Borrelia burgdorferi.</a> Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).</li><li>Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter.">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li><li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli.">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li><li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation.">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li><li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection.">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li><li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus.">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li><li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria.">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).</li><li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+RNA+polymerase:+Tools+and+protocols.">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li><li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli.">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).</li><li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling-circle+RNA+synthesis:+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li><li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription.">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).</li><li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases.">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li></ol>

تم استخدام فحوصات النسخ في المختبر التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول المقدم مؤخرا لدراسة دور عامل النسخ في B. burgdorferi ويمكن تطبيقها لبناء تجارب مماثلة باستخدام عوامل النسخ الأخرى وعوامل سيغما والجزيئات23. بمجرد الحصول على بوليميراز الحمض النووي الريبي النشط من B. ...

يحدث مرض لايم والحمى الانتكاسية بسبب مسببات الأمراض اللولبية في أجناس Borrelia و Borreliella1،2،3. مرض لايم هو مرض بارز ينتقل عن طريق النواقل في أمريكا الشمالية ، وبالتالي ، فإن Borreliella burgdorferi هو كائن نموذجي بارز لدراسة بيولوجيا spirochete 4,5. تهدف التحقيقات في آليات B. burgdorferi لتنظيم النسخ إلى فهم أفضل لتكيفها مع التغيرات في البيئة أثناء دورانها بين ناقل القراد ومضيفات الثدييات 6,7. التغيرات في درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، والأسمولية، وتوافر المغذيات، والأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، والأحماض العضوية، والأكسجين المذاب ومستويات ثاني أكسيد الكربون تعدل التعبير عن الجينات التي تعتبر مهمة ل B. burgdorferi للبقاء على قيد الحياة في ناقل المفصليات وإصابة الحيوانات8،9،10،11،12،13،14،15 ،16,17,18. كان ربط هذه الاستجابات للمنبهات بالآليات التنظيمية جانبا مهما من أبحاث B. burgdorferi 19.
تتحكم عوامل النسخ وعوامل سيغما في نسخ الجينات التي تنفذ العمليات الخلوية. يحتوي لايم واللولبيات الحموية الانتكاسية على مجموعة متفرقة نسبيا من عوامل النسخ وعوامل سيغما البديلة. على الرغم من ذلك ، هناك تغييرات نسخية معقدة توجه استجابات B. burgdorferi للبيئة20،21،22. لا تزال الآليات المحددة التي تقود تغييرات النسخ في B. burgdorferi استجابة للتغيرات البيئية غير واضحة. مقايسات النسخ في المختبر هي أدوات قوية لاستخدام نهج كيميائي حيوي لفحص الوظيفة والآليات التنظيمية لعوامل النسخ وعوامل سيغما23،24،25،26.
تم مؤخرا إنشاء نظام فحص النسخ في المختبر باستخدام بوليميراز B. burgdorferi RNA24. نظرا لأن البكتيريا غالبا ما يكون لها فسيولوجيات خلوية فريدة ، فإن بوليميراز الحمض النووي الريبي من الأنواع والأجناس المختلفة يستجيب بشكل مختلف لتنقية الإنزيم وتخزين الإنزيم وظروف عازلة التفاعل27. B. burgdorferi هو أيضا بعيد وراثيا عن العديد من الأنواع البكتيرية التي تمت فيها دراسة بوليميراز الحمض النوويالريبي 20. يمكن لجوانب تحضير الإنزيم مثل ظروف التحلل والغسيل والشطف العازلة ، ومخزن التخزين المؤقت ، ومخزن تفاعل النسخ في المختبر ، وطريقة بناء الفحص أن تغير جميعها نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي. هنا ، نقدم بروتوكولا لتنقية بوليميراز الحمض النووي الريبي وعامل سيجما RpoD ، وإنتاج قالب الحمض النووي الخطي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، وبناء مقايسات النسخ في المختبر لتسهيل التكاثر بين المختبرات التي تستخدم هذا النظام. نقوم بتفصيل مثال رد فعل لتوضيح النطاق الخطي للنسخ المعتمد على RpoD ومناقشة القيود والبدائل لهذا النهج.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2545</td>
			<td>Step 1.7 and 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C50B</td>
			<td>Step 1.3, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120-9500PK</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78248</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filters 10 Kd cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8010</td>
			<td>Step 1.11 and 2.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt resin and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89969</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>426380500</td>
			<td>Step 1.4 and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (Nuclease)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70746</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Factor Xa Protease&#160;</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCXA-0060</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon 5 Phosphoimager</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>Multiple</td>
			<td>Step 4.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O for in vitro transcription</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>Step 3.2 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Step 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040601</td>
			<td>Step 2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90082</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25401</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25418</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85124</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mixture</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0481</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td>Step 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-PCR28ACF</td>
			<td>Step 1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL Protein Fusion 
			and Purification System Instruction manual</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8200S</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gels AnyKD</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-8125</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU503H</td>
			<td>Step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Loading Dye, (2x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Step 4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea gels 10 percent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4566033</td>
			<td>Step 4.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays

Borreliella burgdorferi هو أحد مسببات الأمراض البكتيرية ذات الذخيرة الأيضية والجينومية المحدودة. ينتقل B. burgdorferi خارج الخلية بين الفقاريات والقراد ويعيد تشكيل ملفه النسخي بشكل كبير للبقاء على قيد الحياة في بيئات متباينة أثناء العدوى. تركز دراسات B. burgdorferi على الفهم الواضح لكيفية استجابة البكتيريا لبيئتها من خلال التغييرات النسخية. تسمح مقايسات النسخ في المختبر بتشريح الآليات الأساسية لتنظيم النسخ كيميائيا حيويا. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يصف تنقية وتخزين بوليميراز B. burgdorferi RNA ، وتنقية عامل سيغما ، وتوليد قالب الحمض النووي ، ومقايسات النسخ في المختبر . يصف البروتوكول استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي المنقى من B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC هي سلالة منشورة سابقا تحتوي على علامة 10XHis على جين rpoC الذي يشفر أكبر وحدة فرعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي. تتكون مقايسات النسخ في المختبر من بوليميراز الحمض النووي الريبي المنقى من السلالة 5A4-RpoC ، ونسخة مؤتلفة من عامل التدبير المنزلي سيجما RpoD ، وقالب الحمض النووي المزدوج الذي تم إنشاؤه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. في حين أن تقنيات تنقية البروتين ومناهج تجميع مقايسات النسخ في المختبر مفهومة جيدا من الناحية المفاهيمية وشائعة نسبيا ، فإن اعتبارات التعامل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي غالبا ما تختلف من كائن حي إلى آخر. تم تصميم البروتوكول المقدم هنا للدراسات الأنزيمية على بوليميراز B. burgdorferi RNA. يمكن تكييف الطريقة لاختبار دور عوامل النسخ والمروجين وتعديلات ما بعد الترجمة على نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي.

في تفاعل النسخ في المختبر الذي تكون فيه الخطوة المحددة للتفاعل هي بدء النسخ بوساطة عامل سيغما ، يجب أن يزداد نشاط النسخ خطيا مع مقدار عامل سيجما. نقدم إعداد تجارب النسخ في المختبر لاختبار مجموعة من تركيزات RpoD جنبا إلى جنب مع تركيزين من بوليميراز الحمض النووي الريبي لمراقبة الإشا?...

Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

يمكن لفحوصات النسخ في المختبر فك رموز آليات تنظيم النسخ في Borreliella burgdorferi. يصف هذا البروتوكول خطوات تنقية بوليميراز B. burgdorferi RNA وإجراء تفاعلات النسخ في المختبر. تتطلب الأساليب التجريبية التي تستخدم مقايسات النسخ في المختبر تنقية وتخزينا موثوقا به لبوليميراز الحمض النووي الريبي النشط.

المكونات الأساسية لبوريليلا (بوريليا) بورغدورفيري في مقايسات النسخ المختبري

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

يوفر نظام فحص النسخ في المختبر ل Borreliella burgdorferi أداة كيميائية حيوية للباحثين لدراسة الآليات التنظيمية الجينية والعوامل التي تحكم النشاط الأنزيمي لبوليميراز الحمض النووي الريبي. يسمح لنا النظام باختبار كيفية تأثير عوامل النسخ والعوامل المساعدة وتركيزات الملح ودرجة الحموضة على وظيفة بوليميراز Borreliella burgdorferi RNA ، مما يساهم في فهمنا العام للآليات التنظيمية للجينات. يمكن أن تسمح لنا هذه التقنية القوية أيضا بفحص الأدوية التي تثبط بوليميراز الحمض النووي الريبي بشكل انتقائي ، مما يفتح الباب أمام تطوير عقاقير جديدة لعلاج داء لايم.للبدء ، اجمع حبيبات الخلية من لترين إلى أربعة لترات من Borreliella burgdorferi RpoC-His10X المستزرعة في وسط BSKII في بيئة محبة للهواء الدقيقة بكثافة تتراوح من اثنين إلى أربعة أضعاف 10 ثابت لكل ملليلتر. بيليه الخلايا في 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في زجاجات الطرد المركزي 500 ملليلتر وتجاهل طاف. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 30 ملليلتر من المخزن المؤقت HN المثلج البارد ، وكرر خطوة الطرد المركزي ، وصب المادة الطافية.أثناء العمل ، حافظ على الخلايا وتحلل البروتينات وتنقيتها عند أربع درجات مئوية أو على الجليد ما لم يتم تجميدها. حافظ على بوليميراز الحمض النووي الريبي في بيئة مختزلة عن طريق إضافة ديثيوثريتول طازج بتركيز 2 مليمولار إلى كل مخزن مؤقت مستخدم والحفاظ على درجة الحموضة 8.0. تحضير المحللة من بيليه خلية Borreliella burgdorferi باستخدام مجموعة تحلل البكتيريا التجارية.أعد تعليق الحبيبات في 10 إلى 15 ملليلتر من محلول B-PER بدون مثبط الأنزيم البروتيني واترك التحلل يستمر لمدة خمس دقائق على الجليد. أضف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني إلى محلول التحلل واستمر في ثلاث جولات من صوتنة. الآن قم بتوضيح تحلل الخلية عن طريق الطرد المركزي والترشيح باستخدام أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.أضف المخزن المؤقت لتحميل عمود الكوبالت إلى المحلول ، مما يجعل الحجم الإجمالي يصل إلى 30 ملليلتر. بيليه حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 20،000 مرة G لمدة 30 دقيقة. في وقت لاحق ، قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر وقم بتخفيف المخزن المؤقت لتحميل عمود المحللة والكوبالت إلى نسبة تخفيف نهائية تبلغ 1:10.قم بإجراء كروماتوغرافيا التقارب على طافت محللات الخلية الموضحة باستخدام عمود راتنج الكوبالت أو النيكل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. احفظ العينات المتدفقة والغسيل والمستخلصة للتحليل. استبدل على الفور محلول محلول بوليميراز الحمض النووي الريبي بمحلول المخزن المؤقت للتخزين باستخدام عمود تبادل المخزن المؤقت باتباع تعليمات الشركة المصنعة.بعد ذلك ، ركز بوليميراز الحمض النووي الريبي بتركيز 0.2 إلى 0.4 ملليغرام لكل ملليلتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي ذات القطع 10 كيلو دالتون. تحديد التركيز بواسطة مقياس الطيف الضوئي وإعداد مخزون التجميد. أحجام Aliquot من 20 إلى 50 ميكرولتر من مخزون تجميد بوليميراز الحمض النووي الريبي في أنابيب PCR وتخزين بوليميراز الحمض النووي الريبي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.قم بإعداد أسطح العمل ، بما في ذلك مقعد الإشعاع ، لتقليل التلوث الإشعاعي. قم بإذابة مخزون بوليميراز الحمض النووي الريبي الطازج و RpoD على الثلج واخلط جميع المخزونات المجمدة المذابة جيدا قبل سحب العينات قم بإعداد خليط تفاعل رئيسي في خليط NTP منفصل للنيوكليوتيدات ذات العلامات المشعة وفقا للمتطلبات التجريبية. توزيع تفاعلات التحكم في مجموعات تجريبية في أنابيب PCR.بعد توزيع الماء ، ومزيج التفاعل ، وبوليميراز الحمض النووي الريبي ، و RpoD في أنابيب PCR المخصصة ، امزج الكواشف عن طريق الماصة. انقل المواد المحضرة إلى مقعد إشعاعي ، وأضف ATP المسمى alpha-32P إلى NTP ، واخلطها عن طريق سحب لطيف. أضف NTP إلى الأنابيب التي تحتوي على مخاليط تفاعل النسخ في المختبر وابدأ تفاعل النسخ في المختبر عن طريق إضافة قالب الحمض النووي.امزج حجم التفاعل عن طريق سحب الأنابيب برفق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في جهاز تدوير حراري أو كتلة حرارية. قم بإزالة التفاعلات من جهاز التدوير الحراري أو الكتلة الحرارية وأوقف تفاعلات النسخ في المختبر عن طريق إضافة حجم متساو من صبغة تحميل 2X RNA تحتوي على 50٪ فورماميد إلى خليط التفاعل. تشوه الإنزيمات عن طريق احتضان التفاعلات عند 65 درجة سلزية لمدة خمس دقائق في دورة حرارية أو كتلة حرارية.باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ، افصل الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر في 10٪ إلى 15٪ TBE من مواد البولي أكريلاميد البوليكريلاميد من اليوريا عند 180 فولت لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد إزالة أي جزء من الجل يحتوي على ATP غير مدمج مشع ، قم بتعريض الجل لشاشة الفوسفو طوال الليل وقم بتصوير الحمض النووي الريبي المشع باستخدام جهاز تصوير فسفوغرافيك. أظهر SDS-PAGE ثلاثة نطاقات تقابل ثلاثة ببتيدات ، RpoC ، RpoB ، و RpoA لمركب بوليميراز الحمض النووي الريبي.كما لوحظ وجود ببتيد من 115 كيلودالتون يطابق حجم Borreliella burgdorferi RpoD المؤتلف الموسوم ب MBP. أدى انشقاق خليط البروتين مع عامل البروتياز XA إلى توليد منتجين مهمين ، RpoD و MBP. تم إنشاء موقع المروج ل Borreliella burgdorferi FLGB بواسطة PCR.يؤدي التخفيف المزدوج لتركيز RpoD إلى انخفاض مستوى منتج الحمض النووي الريبي المتراكم. يعطي تركيز بوليميراز الحمض النووي الريبي المنخفض عددا أقل من منتجات الحمض النووي الريبي عبر نطاق تركيزات RpoD. أشارت إشارة قياس الكثافة إلى وجود علاقة خطية بين كمية RpoD الموجودة في التفاعل في كلتا التجربتين.النشاط الأنزيمي لبوليميراز الحمض النووي الريبي حساس لمجموعة متنوعة من العوامل أثناء عملية التنقية والتخزين والتجريبية. تعطي الإنزيمات والكواشف الطازجة ، إلى جانب التخطيط الجيد ، أفضل فرصة ممكنة للنجاح في هذا البروتوكول.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

الكمي المتزامنة الخلوي ومكونات خارج الخلية من الأغشية الحيوية

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

فحوصات لدراسة دور فيترونيكتين في التصاق البكتيريا ومقاومة المصل

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

في طرق المختبر لمقارنة الهدف وتجليد وCDC التعريفي بين الأجسام المضادة العلاجية: تطبيقات في تحليل Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

إنتاجية عالية في تقييم المختبر من الكمون عكس الوكلاء عن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

الخياطة في فيفو الاختبارات الخلوية لدراسة المناعي في الأورام الخاصةCD8 + T الاستجابات الخلية

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...