Name: essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן ההשקעות האסטרטגיות למדעי הבריאות, מענק פיתוח סגל של אוניברסיטת קרייטון. זן B. burgdorferi RpoC-His10X סופק באדיבות על ידי ד"ר ד. סקוט סמואלס מאוניברסיטת מונטנה. זן E. coli המכיל את פלסמיד pMAL-C5X המקודד אלל rpoD המתויג כחלבון קושר מלטוז סופק באדיבות על ידי ד"ר פרנק גרארדיני ממעבדות הרי הרוקי, NIAID, NIH.

1. טיהור ה-RNA פולימראז והכנת מלאי RNA פולימראז
<ol><li>לאסוף את גלולת התא מ 2-4 L של B. burgdorferi RpoC-His10X בתרבית בתווך BSKII בסביבה מיקרואירופילית (34 ° C, 5% CO 2, 3% O 2) לצפיפות של2-4 x 107 תאים / מ"ל באמצעות פרוטוקולי איסוף תאיםשתוארו קודם לכן 28,29. בצע צ?...

<ol>
	<li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li><li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness.">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li><li>Cutler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapsing+fever+Borreliae:+A+global+review.">Relapsing fever Borreliae: A global review.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).</li><li>Barbour, A. G., Hayes, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Borrelia+species.">Biology of Borrelia species.</a> Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).</li><li>Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+infection+with+Borrelia+burgdorferi.">Biology of infection with Borrelia burgdorferi.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+Lyme+disease+spirochete+with+its+tick+vector.">Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).</li><li>Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weak+organic+acids+decrease+Borrelia+burgdorferi+cytoplasmic+pH,+eliciting+an+acid+stress+response+and+impacting+RpoN-+and+RpoS-dependent+gene+expression.">Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).</li><li>Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+virulence-related+regulatory+pathways+in+Borrelia+burgdorferi+are+directly+affected+by+osmotic+fluxes+in+the+blood+meal+of+feeding+ixodes+ticks.">Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).</li><li>Bugrysheva, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+RelBbu+Regulon+in+Borrelia+burgdorferi+reveals+modulation+of+glycerol+metabolism+by+(p)ppGpp.">Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp.</a> PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).</li><li>Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+pH+on+membrane+proteins+in+Borrelia+burgdorferi.">Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Borrelia+burgdorferi+RelA/SpoT+homolog+and+stringent+response+regulate+survival+in+the+tick+vector+and+global+gene+expression+during+starvation.">The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation.</a> PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).</li><li>Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels.">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li><li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi.">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li><li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+levels+alter+gene+expression+and+antigen+profiles+in+Borrelia+burgdorferi.">Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).</li><li>Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+differential+expression+of+antigens+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).</li><li>Troxell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+and+zinc+regulate+virulence+determinants+in+Borrelia+burgdorferi.">Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+environmental+factors+influencing+reciprocal+patterns+of+gene+expression+in+virulent+Borrelia+burgdorferi.">Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi.</a> Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).</li><li>Samuels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+and+transcriptomics.">Gene regulation and transcriptomics.</a> Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).</li><li>Fraser, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequence+of+a+Lyme+disease+spirochaete,+Borrelia+burgdorferi.">Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi.</a> Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).</li><li>Iyer, R., Schwartz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+comparative+genomic+and+transcriptome+analysis+of+Borrelia+burgdorferi.">Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi.</a> Microarrays. 5 (2), 9 (2016).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+global+alterations+in+the+transcriptomes+of+Lyme+disease+spirochetes+during+tick+feeding+and+following+mammalian+host+adaptation.">Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation.</a> Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity.">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system:+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi.">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).</li><li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors.">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li><li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase:+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements.">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRENDA,+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021:+New+developments+and+updates.">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li><li>Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+and+complementation.">Genetic transformation and complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).</li><li>Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetic transformation of Borrelia burgdorferi.</a> Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).</li><li>Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter.">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li><li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli.">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li><li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation.">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li><li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection.">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li><li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus.">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li><li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria.">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).</li><li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+RNA+polymerase:+Tools+and+protocols.">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li><li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli.">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).</li><li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling-circle+RNA+synthesis:+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li><li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription.">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).</li><li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases.">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li></ol>

מבחני שעתוק חוץ גופיים שנבנו באמצעות הפרוטוקול המוצג שימשו לאחרונה לחקר תפקידו של גורם שעתוק ב- B. burgdorferi וניתן ליישם אותם לבניית ניסויים דומים באמצעות גורמי שעתוק אחרים, גורמי סיגמא ומולקולות23. לאחר קבלת RNA פולימראז פעיל מ- B. burgdorferi וזיהוי פעילותו, ניתן לשנות רכי...

מחלת ליים וקדחת התקפית נגרמות על ידי פתוגנים spirochete בסוגים Borrelia ו Borreliella 1,2,3. מחלת ליים היא מחלה בולטת המועברת על ידי וקטורים בצפון אמריקה, וכתוצאה מכך, Borreliella burgdorferi הוא אורגניזם מודל בולט לחקר ביולוגיה ספירוצ'טה 4,5. מחקרים על מנגנוני ויסות השעתוק של B. burgdorferi נועדו להבין טוב יותר את הסתגלותו לשינויים בסביבה כאשר הוא עובר בין וקטור הקרציות שלו לבין פונדקאים של יונקים 6,7. שינויים ב- pH, טמפרטורה, אוסמולריות, זמינות חומרי מזון, חומצות שומן קצרות שרשרת, חומצות אורגניות ורמות חמצן מומס ופחמן דו חמצני מווסתים את ביטוי הגנים החשובים ל- B. burgdorferi לשרוד בווקטור פרוקי הרגליים שלו ולהדביק בעלי חיים 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. קישור תגובות אלה לגירויים עם מנגנוני ויסות היה היבט חשוב במחקר B. burgdorferi 19.
גורמי שעתוק וגורמי סיגמא שולטים בשעתוק גנים המבצעים תהליכים תאיים. לליים ולספירוצ'טות קדחת התקפיתיות יש קבוצה דלילה יחסית של גורמי שעתוק וגורמי סיגמה חלופיים. למרות זאת, ישנם שינויי שעתוק מורכבים המכוונים את תגובות B. burgdorferi לסביבה20,21,22. המנגנונים הספציפיים המניעים שינויי שעתוק ב- B. burgdorferi בתגובה לשינויים סביבתיים עדיין אינם ברורים. מבחני שעתוק חוץ גופי הם כלים רבי עוצמה לשימוש בגישה ביוכימית להערכת הפונקציה ומנגנוני הבקרה של גורמי שעתוק וגורמי סיגמא23,24,25,26.
לאחרונה הוקמה מערכת בדיקת שעתוק חוץ גופית באמצעות B. burgdorferi RNA polymerase24. מכיוון שלחיידקים יש לעתים קרובות פיזיולוגיות תאיות ייחודיות, RNA פולימראז ממינים וסוגים שונים מגיב באופן שונה לטיהור אנזימים, אחסון אנזימים ותנאי חיץ תגובה27. B. burgdorferi גם מרוחק גנטית ממיני חיידקים רבים שבהם נחקרו RNA פולימראזות20. היבטים של הכנת אנזימים כגון ליזה, שטיפה ותנאי חיץ אלוציה, מאגר אחסון, מאגר תגובת שעתוק חוץ גופית ושיטת בניית הבדיקה יכולים כולם לשנות את פעילות ה- RNA פולימראז. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול לטיהור RNA פולימראז וגורם סיגמא RpoD, ייצור תבנית DNA ליניארית דו-גדילית, ובניית מבחני שעתוק חוץ גופיים כדי להקל על יכולת השחזור בין מעבדות המשתמשות במערכת זו. אנו מפרטים תגובה לדוגמה כדי להדגים את הטווח הליניארי עבור תמלול תלוי RpoD ולדון במגבלות ובחלופות לגישה זו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2545</td>
			<td>Step 1.7 and 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C50B</td>
			<td>Step 1.3, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120-9500PK</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78248</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filters 10 Kd cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8010</td>
			<td>Step 1.11 and 2.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt resin and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89969</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>426380500</td>
			<td>Step 1.4 and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (Nuclease)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70746</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Factor Xa Protease&#160;</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCXA-0060</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon 5 Phosphoimager</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>Multiple</td>
			<td>Step 4.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O for in vitro transcription</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>Step 3.2 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Step 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040601</td>
			<td>Step 2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90082</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25401</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25418</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85124</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mixture</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0481</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td>Step 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-PCR28ACF</td>
			<td>Step 1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL Protein Fusion 
			and Purification System Instruction manual</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8200S</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gels AnyKD</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-8125</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU503H</td>
			<td>Step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Loading Dye, (2x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Step 4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea gels 10 percent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4566033</td>
			<td>Step 4.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays

Borreliella burgdorferi הוא פתוגן חיידקי עם רפרטואר מטבולי וגנומי מוגבל. B. burgdorferi עובר באופן חוץ-תאי בין חולייתנים וקרציות ומשנה באופן דרמטי את פרופיל השעתוק שלו כדי לשרוד בסביבות שונות במהלך זיהום. מוקד המחקר של B. burgdorferi הוא להבין בבירור כיצד החיידק מגיב לסביבתו באמצעות שינויי שעתוק. מבחני שעתוק חוץ גופיים מאפשרים לנתח ביוכימית את המנגנונים הבסיסיים של ויסות השעתוק. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר טיהור ואחסון של B. burgdorferi RNA פולימראז, טיהור גורם סיגמא, יצירת תבניות DNA ומבחני שעתוק חוץ גופי . הפרוטוקול מתאר את השימוש ב-RNA פולימראז מטוהר מ-B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC הוא זן שפורסם בעבר בעל תג 10XHis על הגן rpoC המקודד את תת-היחידה הגדולה ביותר של RNA פולימראז. בדיקות שעתוק חוץ גופיות מורכבות מ-RNA פולימראז מטוהר מזן 5A4-RpoC, גרסה רקומביננטית של גורם הסיגמא RpoD, ותבנית DNA דו-גדילי הנוצרת על ידי PCR. בעוד שטכניקות טיהור החלבונים והגישות להרכבה במבחני שעתוק חוץ גופי מובנות היטב ונפוצות יחסית, שיקולי הטיפול בפולימראז RNA שונים לעתים קרובות מאורגניזם לאורגניזם. הפרוטוקול המוצג כאן מיועד למחקרים אנזימטיים על B. burgdorferi RNA polymerase. ניתן להתאים את השיטה לבדיקת תפקידם של גורמי שעתוק, מקדמים ושינויים לאחר תרגום על פעילות ה-RNA פולימראז.

בתגובת שעתוק חוץ גופית שבה השלב המגביל של התגובה הוא התחלת שעתוק בתיווך גורם סיגמא, פעילות השעתוק צריכה לגדול באופן ליניארי עם כמות גורם הסיגמא. אנו מציגים את ההכנה של ניסויי שעתוק חוץ גופי הבודקים טווח של ריכוזי RpoD יחד עם שני ריכוזים של RNA פולימראז כדי לצפות באות המשתנה המתקבל מש...

Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

מבחני שעתוק חוץ גופיים יכולים לפענח את מנגנוני ויסות השעתוק בבורליאלה בורגדורפרי. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לטיהור B. burgdorferi RNA פולימראז וביצוע תגובות שעתוק חוץ גופי. גישות ניסיוניות המשתמשות במבחני שעתוק חוץ גופי דורשות טיהור ואחסון אמינים של RNA פולימראז פעיל.

רכיבים חיוניים של Borreliella (Borrelia) burgdorferi בדיקות תמלול חוץ גופי

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

מערכת בדיקת השעתוק במבחנה עבור Borreliella burgdorferi מספקת כלי ביוכימי לחוקרים לחקור מנגנוני בקרה גנטיים וגורמים השולטים בפעילות האנזימטית של RNA פולימראז. המערכת מאפשרת לנו לבחון כיצד גורמי שעתוק, קו-פקטורים, ריכוזי מלחים ו-pH משפיעים על תפקוד ה-RNA פולימראז Borreliella burgdorferi, מה שתורם להבנה הכוללת שלנו של מנגנוני בקרת גנים. טכניקה רבת עוצמה זו יכולה גם לאפשר לנו לסנן תרופות המעכבות באופן סלקטיבי RNA פולימראז, ולפתוח את הדלת לפיתוח תרופות חדשניות לטיפול בבורליוזיס ליים.כדי להתחיל, לאסוף את גלולת התא מ שניים עד ארבעה ליטר של Borreliella burgdorferi RpoC-His10X תרבית בתווך BSKII בסביבה microaerophilic לצפיפות של שניים עד ארבעה פעמים 10 קבוע למיליליטר. גלולה את התאים ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בבקבוקים צנטריפוגליים 500 מיליליטר ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים ב -30 מיליליטר של חיץ HN קר כקרח, חזור על שלב הצנטריפוגה, ונטרל את הסופרנטנט.תוך כדי עבודה, שמרו על התאים, הליזט והחלבונים המטוהרים בארבע מעלות צלזיוס או על קרח אלא אם כן הם קופאים. שמור על RNA פולימראז בסביבה מפחיתה על ידי הוספת dithiothreitol טרי מוכן בריכוז של שני מילימולר לכל חיץ בשימוש ולשמור על pH 8.0. הכינו ליזט מכדורית התא Borreliella burgdorferi באמצעות ערכת ליזה חיידקית מסחרית.השהה מחדש את הגלולה ב 10 עד 15 מיליליטר של תמיסת B-PER ללא מעכב פרוטאז ואפשר לליזה להמשיך במשך חמש דקות על קרח. הוסיפו קוקטייל מעכב פרוטאז לתמיסת הליזיס והמשיכו בשלושה סבבים של סוניקציה. כעת להבהיר את התא ליזט על ידי צנטריפוגה וסינון באמצעות צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.הוסף מאגר טעינת עמודת קובלט לתמיסה, והפוך את הנפח הכולל לעד 30 מיליליטר. גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G במשך 30 דקות. לאחר מכן, מסננים את הסופרנאטנט באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר ומדללים את מאגר העמסת עמוד הליזט והקובלט ליחס דילול סופי של 1:10.בצע כרומטוגרפיית זיקה על הסופרנאטנט ליזט התא המובהר באמצעות עמודת שרף קובלט או ניקל בהתאם להוראות היצרן. שמור את הדגימות הזורמות, השטיפה והמדוללות לצורך ניתוח. החלף באופן מיידי את תמיסת החיץ של תמיסת RNA פולימראז בתמיסת מאגר האחסון באמצעות עמודת החלפת מאגר בהתאם להוראות היצרן.לאחר מכן, רכז את ה-RNA פולימראז לריכוז של 0.2 עד 0.4 מיליגרם למיליליטר באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות בחיתוך 10 קילו-דלטון. לקבוע את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר ולהכין את מלאי ההקפאה. Aliquot 20 עד 50 מיקרוליטר נפחים של RNA פולימראז הקפאת מלאי בצינורות PCR ולאחסן את RNA פולימראז במינוס 80 מעלות צלזיוס.הכינו את משטחי העבודה, כולל ספסל הקרינה, להפחתת זיהום קרינה. הפשירו RNA פולימראז טרי ומלאי RpoD על קרח וערבבו היטב את כל המלאים הקפואים המופשרים לפני הפיפטינג הכינו תערובת תגובת אב בתערובת NTP נפרדת לנוקלאוטידים מסומנים ברדיו בהתאם לדרישות הניסוי. לחלק את תגובות הבקרה בקבוצות ניסוי לתוך צינורות PCR.לאחר ניפוק מים, תערובת תגובה, RNA פולימראז ו- RpoD לצינורות PCR ייעודיים, מערבבים את הריאגנטים על ידי פיפטציה. מעבירים את החומרים המוכנים לספסל קרינה, מוסיפים ATP עם תווית אלפא-32P ל-NTP ומערבבים באמצעות פיפטינג עדין. הוסף NTP לצינורות המכילים את תערובות תגובת השעתוק במבחנה והתחל את תגובת השעתוק במבחנה על ידי הוספת תבנית DNA.מערבבים את נפח התגובה על ידי פיפטציה עדינה ודגרים על הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בתרמוסייקלר או בלוק חום. הסר את התגובות מהתרמוסייקלר או בלוק החום ועצור את תגובות השעתוק במבחנה על ידי הוספת נפח שווה של צבע טעינת RNA פי 2 המכיל 50% פורממיד לתערובת התגובה. פירוק האנזימים על ידי דגירה על תגובות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בתרמוסייקלר או בלוק חום.באמצעות אלקטרופורזה בג'ל, יש להפריד את ה-RNA המשועתק במבחנה בג'ל פוליאקרילאמיד אוריאה של 10% עד 15%TBE במתח של 180 וולט למשך 30 עד 45 דקות. לאחר הסרת כל חלק של הג'ל המכיל ATP לא משולב, חשוף את הג'ל למסך הפוספו למשך הלילה וצלם את הרנ"א המסומן ברדיו באמצעות מצלמת פוספו. SDS-PAGE הראה שלושה פסים המתאימים לשלושה פפטידים, RpoC, RpoB ו-RpoA של קומפלקס RNA פולימראז.כמו כן נצפה פפטיד של 115 קילודלטון התואם את גודלו של הרקומביננטי Borreliella burgdorferi RpoD המתויג MBP. פיצול תערובת החלבונים עם פרוטאז פקטור XA הוביל ליצירת שני מוצרים משמעותיים, RpoD ו- MBP. אתר היזם של Borreliella burgdorferi FLGB נוצר על ידי PCR.דילול כפול של ריכוז RpoD מוליד רמה נמוכה יותר של תוצר הרנ"א המצטבר. ריכוז RNA פולימראז נמוך נותן פחות תוצרי RNA בטווח ריכוזי RpoD. אות הצפיפות הצביע על קשר ליניארי בין כמות RpoD הקיימת בתגובה בשני הניסויים.הפעילות האנזימטית של RNA פולימראז רגישה למגוון גורמים במהלך תהליך הטיהור, האחסון והניסוי. אנזימים וריאגנטים טריים, יחד עם תכנון טוב, נותנים את הסיכוי הטוב ביותר להצלחה בפרוטוקול זה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

מבחני ללמוד את התפקיד של Vitronectin הידבקות חיידקים עמידות סרום

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...