Name: essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

この作業は、クレイトン大学の健康科学戦略的投資基金教員開発助成金によってサポートされました。B. burgdorferi RpoC-His10X株は、モンタナ大学のD. Scott Samuels博士から親切に提供されました。マルトース結合タンパク質タグ付きrpoD対立遺伝子をコードするpMAL-C5Xプラスミドを有する大腸菌株は、NIAID、NIH、ロッキーマウンテンラボラトリーズのフランクゲラルディーニ博士から親切に提供されました。

1. RNAポリメラーゼの精製とRNAポリメラーゼ原液の調製
<ol><li>前述の細胞収集プロトコル28,29を使用して、微好気性環境(34°C、5%CO2、3%O2)でBSKII培地で培養した2〜4 LのB.ブルグドルフェリRpoC-His10Xから2〜4 x 107細胞/ mLの密度まで細胞ペレットを収集します。500 mL遠心ボトルで10,000 x g、4°Cで30分間遠心?...

<ol>
	<li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li><li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness.">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li><li>Cutler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapsing+fever+Borreliae:+A+global+review.">Relapsing fever Borreliae: A global review.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).</li><li>Barbour, A. G., Hayes, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Borrelia+species.">Biology of Borrelia species.</a> Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).</li><li>Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+infection+with+Borrelia+burgdorferi.">Biology of infection with Borrelia burgdorferi.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+Lyme+disease+spirochete+with+its+tick+vector.">Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).</li><li>Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weak+organic+acids+decrease+Borrelia+burgdorferi+cytoplasmic+pH,+eliciting+an+acid+stress+response+and+impacting+RpoN-+and+RpoS-dependent+gene+expression.">Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).</li><li>Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+virulence-related+regulatory+pathways+in+Borrelia+burgdorferi+are+directly+affected+by+osmotic+fluxes+in+the+blood+meal+of+feeding+ixodes+ticks.">Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).</li><li>Bugrysheva, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+RelBbu+Regulon+in+Borrelia+burgdorferi+reveals+modulation+of+glycerol+metabolism+by+(p)ppGpp.">Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp.</a> PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).</li><li>Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+pH+on+membrane+proteins+in+Borrelia+burgdorferi.">Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Borrelia+burgdorferi+RelA/SpoT+homolog+and+stringent+response+regulate+survival+in+the+tick+vector+and+global+gene+expression+during+starvation.">The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation.</a> PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).</li><li>Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels.">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li><li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi.">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li><li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+levels+alter+gene+expression+and+antigen+profiles+in+Borrelia+burgdorferi.">Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).</li><li>Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+differential+expression+of+antigens+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).</li><li>Troxell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+and+zinc+regulate+virulence+determinants+in+Borrelia+burgdorferi.">Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+environmental+factors+influencing+reciprocal+patterns+of+gene+expression+in+virulent+Borrelia+burgdorferi.">Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi.</a> Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).</li><li>Samuels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+and+transcriptomics.">Gene regulation and transcriptomics.</a> Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).</li><li>Fraser, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequence+of+a+Lyme+disease+spirochaete,+Borrelia+burgdorferi.">Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi.</a> Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).</li><li>Iyer, R., Schwartz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+comparative+genomic+and+transcriptome+analysis+of+Borrelia+burgdorferi.">Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi.</a> Microarrays. 5 (2), 9 (2016).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+global+alterations+in+the+transcriptomes+of+Lyme+disease+spirochetes+during+tick+feeding+and+following+mammalian+host+adaptation.">Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation.</a> Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity.">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system:+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi.">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).</li><li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors.">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li><li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase:+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements.">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRENDA,+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021:+New+developments+and+updates.">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li><li>Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+and+complementation.">Genetic transformation and complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).</li><li>Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetic transformation of Borrelia burgdorferi.</a> Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).</li><li>Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter.">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li><li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli.">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li><li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation.">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li><li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection.">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li><li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus.">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li><li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria.">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).</li><li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+RNA+polymerase:+Tools+and+protocols.">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li><li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli.">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).</li><li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling-circle+RNA+synthesis:+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li><li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription.">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).</li><li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases.">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li></ol>

提示されたプロトコルを使用して構築されたインビトロ転写アッセイは、最近、B. burgdorferiにおける転写因子の役割を研究するために使用され、他の転写因子、シグマ因子、および分子を使用して同様の実験を構築するために適用できます23。B. burgdorferiから活性RNAポリメラーゼが得られ、その活性が検出されると、in vitro転写アッセイ内の成分お?...

ライム病と再発熱は、ボレリア属とボレリエラ属のスピロヘータ病原体によって引き起こされます1,2,3。ライム病は北米で著名なベクター媒介性疾患であり、その結果、ボレリエラ・ブルグドルフェリはスピロヘータ生物学を研究するための著名なモデル生物です4,5。B. burgdorferiの転写調節機構の調査は、ダニベクターと哺乳類宿主の間を循環する際の環境の変化への適応をよりよく理解することを目的としています6,7。pH、温度、浸透圧、栄養素の利用可能性、短鎖脂肪酸、有機酸、溶存酸素および二酸化炭素レベルの変化は、B. burgdorferiがその節足動物ベクターで生存し、動物に感染するために重要な遺伝子の発現を調節します8,9,10,11,12,13,14,15、16、17、18。刺激に対するこれらの反応を調節メカニズムと結びつけることは、B. burgdorferi研究の重要な側面でした19。
転写因子とシグマ因子は、細胞プロセスを実行する遺伝子の転写を制御します。ライムと再発熱のスピロヘータは、比較的まばらな転写因子と代替シグマ因子のセットを持っています。それにもかかわらず、環境に対するB.ブルグドルフェリ応答を指示する複雑な転写変化があります20,21,22。環境変化に応答してB. burgdorferiの転写変化を引き起こす特定のメカニズムは不明のままである。in vitro転写アッセイは、転写因子およびシグマ因子の機能と調節機構をアッセイするための生化学的アプローチを採用するための強力なツールです23、24、25、26。
B. burgdorferi RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写アッセイ系が最近確立されました24。細菌はしばしば独特の細胞生理学を持っているので、異なる種と属のRNAポリメラーゼは、酵素精製、酵素貯蔵、および反応緩衝条件に対して異なる反応を示します27。B. burgdorferiはまた、RNAポリメラーゼが研究されている多くの細菌種から遺伝的に離れています20。溶解、洗浄、および溶出バッファー条件、保存バッファー、in vitro転写反応バッファー、およびアッセイ構築方法などの酵素調製の態様はすべて、RNAポリメラーゼ活性を変化させる可能性があります。ここでは、RNAポリメラーゼとシグマ因子RpoDの精製、線状二本鎖DNAテンプレートの作成、およびこのシステムを使用するラボ間の再現性を促進するためのin vitro転写アッセイの構築のためのプロトコルを提供します。RpoD依存性転写の線形範囲を実証するために反応例を詳述し、このアプローチの限界と代替案について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2545</td>
			<td>Step 1.7 and 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C50B</td>
			<td>Step 1.3, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120-9500PK</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78248</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filters 10 Kd cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8010</td>
			<td>Step 1.11 and 2.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt resin and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89969</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>426380500</td>
			<td>Step 1.4 and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (Nuclease)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70746</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Factor Xa Protease&#160;</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCXA-0060</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon 5 Phosphoimager</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>Multiple</td>
			<td>Step 4.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O for in vitro transcription</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>Step 3.2 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Step 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040601</td>
			<td>Step 2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90082</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25401</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25418</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85124</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mixture</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0481</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td>Step 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-PCR28ACF</td>
			<td>Step 1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL Protein Fusion 
			and Purification System Instruction manual</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8200S</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gels AnyKD</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-8125</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU503H</td>
			<td>Step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Loading Dye, (2x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Step 4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea gels 10 percent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4566033</td>
			<td>Step 4.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays

ボレリエラ・ブルグドルフェリは、代謝およびゲノムレパートリーが限られている細菌性病原体です。B. burgdorferiは脊椎動物とマダニの間を細胞外に通過し、感染中に異なる環境で生き残るためにその転写プロファイルを劇的に再構築します。B. burgdorferi研究の焦点は、細菌が転写変化を通じてその環境にどのように反応するかを明確に理解することです。in vitro転写アッセイは、転写調節の基本的なメカニズムを生化学的に解剖することを可能にします。ここでは、B. burgdorferi RNAポリメラーゼの精製と保存、シグマ因子の精製、DNAテンプレートの生成、およびin vitro転写アッセイを説明する詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、B. burgdorferi 5A4 RpoC-His(5A4-RpoC)から精製されたRNAポリメラーゼの使用を記載している。5A4-RpoCは、RNAポリメラーゼの最大サブユニットをコードするrpoC遺伝子に10XHisタグを有する、以前に発表された株です。インビトロ転写アッセイは、株5A4-RpoCから精製されたRNAポリメラーゼ、ハウスキーピングシグマ因子RpoDの組換えバージョン、およびPCRで生成された二本鎖DNAテンプレートで構成されています。in vitro転写アッセイを組み立てるためのタンパク質精製技術とアプローチは概念的によく理解されており、比較的一般的ですが、RNAポリメラーゼの取り扱いに関する考慮事項は生物ごとに異なることがよくあります。ここで紹介するプロトコルは、B. burgdorferi RNAポリメラーゼの酵素研究用に設計されています。この方法は、RNAポリメラーゼの活性に対する転写因子、プロモーター、および翻訳後修飾の役割を試験するために適合させることができる。

反応の制限段階がシグマ因子を介した転写開始である in vitro 転写反応では、転写活性はシグマ因子の量とともに直線的に増加するはずです。RNA産物への放射性標識ヌクレオチドの取り込みから生じる変化するシグナルを観察するために、2つの濃度のRNAポリメラーゼとともにさまざまなRpoD濃度をテストする in vitro 転写実験の準備を紹介します。RNAポリメラーゼ、RpoD、および二?...

Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

インビトロ 転写アッセイは、 ボレリエラ・ブルグドルフェリにおける転写調節のメカニズムを解読することができる。このプロトコルでは、 B. burgdorferi RNAポリメラーゼを精製し、 in vitro 転写反応を実行する手順について説明します。 in vitro 転写アッセイを用いた実験的アプローチでは、活性RNAポリメラーゼの信頼性の高い精製と保存が必要です。

ボレリエラ(ボレリア)ブルグドルフェリの必須成分 in vitro転写アッセイ

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

Borreliella burgdorferiのin vitro転写アッセイシステムは、研究者がRNAポリメラーゼの酵素活性を支配する遺伝子調節メカニズムと因子を研究するための生化学的ツールを提供します。このシステムにより、転写因子、補因子、塩濃度、pHがボレリエラ・ブルグドルフェリRNAポリメラーゼの機能にどのように影響するかをテストでき、遺伝子制御メカニズムの全体的な理解に貢献します。この強力な技術により、RNAポリメラーゼを選択的に阻害する薬物をスクリーニングすることもでき、ライムボレリア症を治療するための新薬の開発への扉が開かれます。はじめに、2〜4リットルのボレリエラ・ブルグドルフェリRpoC-His10Xを微好気性環境でBSKII培地で培養し、1ミリリットルあたり10定数の2〜4倍の密度で細胞ペレットを収集します。細胞を10, 000倍Gで500ミリリットルの遠心ボトル中で摂氏4度で30分間ペレット化し、上清を捨てる。次いで、細胞を30ミリリットルの氷冷HN緩衝液に再懸濁し、遠心分離工程を繰り返し、上清をデカントした。作業中は、凍結しない限り、細胞、ライセート、および精製タンパク質を摂氏4度または氷上で維持します。使用するすべてのバッファーに2ミリモルの濃度で新たに調製したジチオスレイトールを添加し、pH 8.0を維持することにより、RNAポリメラーゼを還元環境に保ちます。市販の細菌溶解キットを使用して、ボレリエラ・ブルグドルフェリ細胞ペレットからライセートを調製します。プロテアーゼ阻害剤を含まない10〜15ミリリットルのB-PER溶液にペレットを再懸濁し、氷上で5分間溶解を進行させます。溶解溶液にプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加し、超音波処理の3ラウンドを進めます。次に、50ミリリットルの遠沈管を使用した遠心分離とろ過によって細胞溶解液を清澄化します。コバルトカラムローディングバッファーを溶液に加え、総容量を最大30ミリリットルにします。細胞残渣を20, 000倍Gで30分間遠心分離してペレット化する。その後、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して上清をろ過し、ライセートとコバルトカラムローディングバッファーを最終希釈比1:10に希釈します。製造元の指示に従って、コバルトまたはニッケル樹脂カラムを使用して、清澄化された細胞ライセート上清に対してアフィニティークロマトグラフィーを実行します。フロースルー、洗浄、溶出したサンプルを分析用に保存します。直ちにRNAポリメラーゼ溶液の緩衝液と保存緩衝液と交換し、製造元の指示に従って緩衝液交換カラムを使用します。次に、10キロダルトンカットオフ遠心フィルターユニットを使用して、RNAポリメラーゼをミリリットルあたり0.2〜0.4ミリグラムの濃度に濃縮します。分光光度計で濃度を決定し、凍結ストックを準備します。20〜50マイクロリットルの量のRNAポリメラーゼ凍結ストックをPCRチューブに分注し、RNAポリメラーゼを摂氏マイナス80度で保管します。放射線汚染を減らすために、放射線ベンチを含む作業面を準備します。新鮮なRNAポリメラーゼとRpoDストックを氷上で解凍し、ピペッティングの前に解凍したすべての凍結ストックを完全に混合します 実験要件に従って、放射性標識ヌクレオチド用の別のNTP混合物でマスター反応混合物を調製します。実験セット内のコントロール反応をPCRチューブに分注します。水、反応ミックス、RNAポリメラーゼ、およびRpoDを指定されたPCRチューブに分注した後、ピペッティングによって試薬を混合します。調製した材料を放射線ベンチに移し、α-32P標識ATPをNTPに加え、穏やかにピペッティングして混合します。in vitro転写反応混合物を含むチューブにNTPを添加し、DNAテンプレートを追加してin vitro転写反応を開始します。穏やかにピペッティングして反応量を混合し、サーモサイクラーまたはヒートブロックで37°Cで5分間チューブをインキュベートします。サーモサイクラーまたはヒートブロックから反応物を取り出し、50%ホルムアミドを含む等量の2X RNAローディング色素を反応混合物に添加して、in vitro転写反応を停止します。サーモサイクラーまたはヒートブロック中で65°Cで5分間反応をインキュベートすることによる酵素の変性。ゲル電気泳動を使用して、in vitro転写RNAを10%〜15%TBE尿素ポリアクリルアミドゲル中で180ボルトで30〜45分間分離します。取り込まれていない放射性標識ATPを含むゲルの任意の部分を除去した後、ゲルをホスホスクリーンに一晩さらし、ホスホスクリーンイメージャーを使用して放射性標識RNAを画像化します。SDS-PAGEは、RNAポリメラーゼ複合体の3つのペプチド、RpoC、RpoB、およびRpoAに対応する3つのバンドを示しました。MBPタグ付き組換え体Borreliella burgdorferi RpoDのサイズに一致する115キロダルトンのペプチドも観察された。第XA因子プロテアーゼによるタンパク質混合物の切断は、RpoDとMBPの2つの重要な産物の生成につながりました。ボレリエラ・ブルグドルフェリFLGBのプロモーター部位をPCRにより作製した。RpoD濃度を2倍に希釈すると、蓄積されたRNA産物のレベルが低下します。RNAポリメラーゼ濃度が低いと、RpoD濃度の範囲全体でRNA産物が少なくなります。デンシトメトリーシグナルは、両方の実験において反応中に存在するRpoDの量の間の線形関係を示した。RNAポリメラーゼの酵素活性は、精製、保存、および実験プロセス中のさまざまな要因に敏感です。新鮮な酵素と試薬は、適切な計画とともに、このプロトコルで成功する可能性を最大限に高めます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

治療抗体間の標的結合およびCDC誘導を比較するためのインビトロ法：Biosimilarity Analysisにおける応用

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

インビトロバス発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内細菌叢との相互作用の解析

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...