Name: essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

이 작업은 Creighton University의 Health Sciences Strategic Investment Fund Faculty Development Grant의 지원을 받았습니다. B. burgdorferi RpoC-His10X 균주는 몬태나 대학의 D. Scott Samuels 박사가 친절하게 제공했습니다. 맥아당 결합 단백질 태그가 부착된 rpoD 대립유전자를 암호화하는 pMAL-C5X 플라스미드를 보유하는 대장균 균주는 NIH NIAID에 있는 Rocky Mountain Laboratories의 Frank Gherardini 박사가 친절하게 제공했습니다.

1. RNA 중합효소의 정제 및 RNA 중합효소 스톡의 제조
<ol><li>미세호기성 환경(34°C, 5% CO 2, 3% O 2)에서 BSKII 배지에서 배양된 B. burgdorferi RpoC-His10X의 2-4L에서 이전에 설명한 세포 수집 프로토콜28,29를 사용하여2-4 x 107 cells/mL의 밀도로 세포 펠릿을 수집합니다. 500mL 원심분리 병에서 4°C에서 10,000 x g에서 30분 ?...

<ol>
	<li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li><li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness.">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li><li>Cutler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapsing+fever+Borreliae:+A+global+review.">Relapsing fever Borreliae: A global review.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).</li><li>Barbour, A. G., Hayes, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Borrelia+species.">Biology of Borrelia species.</a> Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).</li><li>Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+infection+with+Borrelia+burgdorferi.">Biology of infection with Borrelia burgdorferi.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels.">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li><li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi.">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li><li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+levels+alter+gene+expression+and+antigen+profiles+in+Borrelia+burgdorferi.">Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).</li><li>Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity.">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system:+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi.">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).</li><li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors.">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li><li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase:+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements.">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRENDA,+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021:+New+developments+and+updates.">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li><li>Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+and+complementation.">Genetic transformation and complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).</li><li>Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetic transformation of Borrelia burgdorferi.</a> Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).</li><li>Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter.">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li><li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli.">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li><li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation.">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li><li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection.">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li><li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus.">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li><li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria.">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).</li><li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+RNA+polymerase:+Tools+and+protocols.">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li><li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli.">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).</li><li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling-circle+RNA+synthesis:+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li><li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription.">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).</li><li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases.">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li></ol>

제시된 프로토콜을 사용하여 구성된 시험관 내 전사 분석은 최근 B. burgdorferi에서 전사 인자의 역할을 연구하는 데 사용되었으며 다른 전사 인자, 시그마 인자 및 분자23을 사용하여 유사한 실험을 구축하는 데 적용될 수 있습니다. B. burgdorferi의 활성 RNA 중합효소를 얻고 그 활성이 검출되면 시험관 내 전사 분석 내의 구성 요소 및 조건을 수정할 수 있습...

라임병과 재발열은 Borrelia 및 Borreliella 속의 스피로헤타 병원 균에 의해 발생합니다 1,2,3. 라임병은 북미에서 두드러진 매개체 매개 질병이며, 결과적으로 Borreliella burgdorferi는 스피로헤타 생물학을 연구하는 저명한 모델 유기체입니다 4,5. 전사 조절의 B. burgdorferi 메커니즘에 대한 조사는 진드기 벡터와 포유류 숙주 사이를 순환할 때 환경 변화에 대한 적응을 더 잘 이해하는 것을 목표로 합니다 6,7. pH, 온도, 삼투압, 영양소 가용성, 단쇄 지방산, 유기산, 용존 산소 및 이산화탄소 수준의 변화는 B. burgdorferi가 절지동물 벡터에서 생존하고 동물을 감염시키는 데 중요한 유전자의 발현을 조절합니다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. 자극에 대한 이러한 반응을 조절 메커니즘과 연결하는 것은 B. burgdorferi 연구19의 중요한 측면이었습니다.
전사 인자와 시그마 인자는 세포 과정을 수행하는 유전자의 전사를 조절합니다. 라임과 재발열 스피로헤타에는 비교적 희박한 전사 인자와 대체 시그마 인자 세트가 있습니다. 그럼에도 불구하고 B. burgdorferi가 환경에 대한 반응을 지시하는 복잡한 전사 변화가 있습니다20,21,22. 환경 변화에 대한 반응으로 B. burgdorferi의 전사 변화를 유도하는 구체적인 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 시험관 내 전사 분석은 전사 인자 및 시그마 인자23,24,25,26의 기능 및 조절 메커니즘을 분석하기 위해 생화학적 접근법을 사용하기 위한 강력한 도구입니다.
B. burgdorferi RNA 중합효소를 이용한 시험관 전사 분석 시스템이 최근에 확립되었다24. 박테리아는 종종 독특한 세포 생리학을 가지고 있기 때문에 다른 종과 속의 RNA 중합효소는 효소 정제, 효소 저장 및 반응 완충 조건에 다르게 반응합니다27. B. burgdorferi는 또한 RNA 중합효소가 연구된 많은 박테리아 종과 유전적으로 거리가 멀다20. 용해, 세척 및 용출 완충액 조건, 저장 완충액, 시험관내 전사 반응 완충액 및 분석 구축 방법과 같은 효소 준비의 측면은 모두 RNA 중합효소 활성을 변경할 수 있습니다. 여기에서 우리는 RNA 중합효소 및 시그마 인자 RpoD의 정제, 선형 이중 가닥 DNA 템플릿의 생산 및 이 시스템을 사용하는 실험실 간의 재현성을 용이하게 하기 위한 시험관 내 전사 분석의 구축을 위한 프로토콜을 제공합니다. RpoD 의존적 전사의 선형 범위를 보여주기 위한 반응의 예를 자세히 설명하고 이 접근 방식의 한계와 대안에 대해 논의합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2545</td>
			<td>Step 1.7 and 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C50B</td>
			<td>Step 1.3, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120-9500PK</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78248</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filters 10 Kd cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8010</td>
			<td>Step 1.11 and 2.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt resin and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89969</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>426380500</td>
			<td>Step 1.4 and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (Nuclease)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70746</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Factor Xa Protease&#160;</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCXA-0060</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon 5 Phosphoimager</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>Multiple</td>
			<td>Step 4.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O for in vitro transcription</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>Step 3.2 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Step 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040601</td>
			<td>Step 2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90082</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25401</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25418</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85124</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mixture</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0481</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td>Step 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-PCR28ACF</td>
			<td>Step 1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL Protein Fusion 
			and Purification System Instruction manual</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8200S</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gels AnyKD</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-8125</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU503H</td>
			<td>Step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Loading Dye, (2x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Step 4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea gels 10 percent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4566033</td>
			<td>Step 4.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays

Borreliella burgdorferi 는 대사 및 게놈 레퍼토리가 제한된 박테리아 병원체입니다. B. burgdorferi 는 척추동물과 진드기 사이를 세포 외로 이동하며 감염 시 이질적인 환경에서 생존하기 위해 전사 프로필을 극적으로 개조합니다. B. burgdorferi 연구의 초점은 박테리아가 전사 변화를 통해 환경에 어떻게 반응하는지 명확하게 이해하는 것입니다. 시험관 내 전사 분석을 통해 전사 조절의 기본 메커니즘을 생화학적으로 해부할 수 있습니다. 여기에서 우리는 B. burgdorferi RNA 중합효소 정제 및 저장, 시그마 인자 정제, DNA 템플릿 생성 및 시험관 내 전사 분석을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 B. burgdorferi 5A4 RpoC-His(5A4-RpoC)로부터 정제된 RNA 중합효소의 사용을 설명한다. 5A4-RpoC는 RNA 중합효소의 가장 큰 서브유닛을 코딩하는 rpoC 유전자에 10XHis-태그를 보유하는 이전에 발표된 균주입니다. 시험관내 전사 분석은 균주 5A4-RpoC로부터 정제된 RNA 중합효소, 하우스키핑 시그마 인자 RpoD의 재조합 버전 및 PCR 생성 이중 가닥 DNA 템플릿으로 구성됩니다. 체외 전사 분석을 조립하기 위한 단백질 정제 기술 및 접근 방식은 개념적으로 잘 알려져 있고 비교적 일반적이지만, RNA 중합효소에 대한 취급 고려 사항은 종종 유기체마다 다릅니다. 여기에 제시된 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소에 대한 효소 연구를 위해 설계되었습니다. 상기 방법은 RNA 중합효소의 활성에 대한 전사 인자, 프로모터 및 번역후 변형의 역할을 시험하기 위해 적응될 수 있다.

반응의 제한 단계가 시그마 인자-매개 전사 개시인 시험관내 전사 반응에서, 전사 활성은 시그마 인자의 양에 따라 선형적으로 증가해야 한다. 우리는 RNA 산물에 방사성 표지 된 뉴클레오티드 결합의 결과적인 다양한 신호를 관찰하기 위해 두 가지 농도의 RNA 중합 효소와 함께 다양한 RpoD 농도를 테스트하는 시험관 내 전사 실험의 준비를 제시합니다. RNA 중합효소, RpoD, 및 이중-가닥 D...

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Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

시험관 내 전사 분석은 Borreliella burgdorferi의 전사 조절 메커니즘을 해독할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소를 정제하고 시험관 내 전사 반응을 수행하는 단계를 설명합니다. 시험관 전사 분석을 사용하는 실험적 접근법은 활성 RNA 중합효소의 신뢰할 수 있는 정제 및 보관을 필요로 합니다.

Borreliella (Borrelia) burgdorferi의 필수 성분 In Vitro Transcription Assays

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

Borreliella burgdorferi의 시험관 내 전사 분석 시스템은 연구자가 RNA 중합효소의 효소 활성을 제어하는 유전자 조절 메커니즘 및 인자를 연구할 수 있는 생화학적 도구를 제공합니다. 이 시스템을 통해 전사 인자, 보조 인자, 염 농도 및 pH가 Borreliella burgdorferi RNA 중합효소 기능에 어떤 영향을 미치는지 테스트할 수 있으며, 이는 유전자 조절 메커니즘에 대한 전반적인 이해에 기여합니다. 이 강력한 기술을 통해 RNA 중합효소를 선택적으로 억제하는 약물을 스크리닝할 수 있어 라임 보렐리아증을 치료하기 위한 새로운 약물 개발의 문을 열 수 있습니다.시작하기 위해, 미세 호기성 환경에서 BSKII 배지에서 배양 된 Borreliella burgdorferi RpoC-His10X의 2-4 리터에서 밀리 리터당 10 일정의 밀도로 2-4 리터의 세포 펠릿을 수집합니다. 500 밀리리터 원심 병에서 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000 배 G에서 세포를 펠렛으로 만들고 상청액을 버린다. 이어서, 세포를 30 밀리리터의 빙냉 HN 완충액에 재현탁시키고, 원심분리 단계를 반복하고, 상청액을 경사 조절한다.작업하는 동안 세포, 용해물 및 정제된 단백질을 섭씨 4도 또는 얼지 않는 한 얼음 위에 유지하십시오. 사용된 모든 완충액에 2밀리몰 농도로 새로 제조된 디티오트레이톨을 첨가하여 RNA 중합효소를 환원 환경에 유지하고 pH 8.0을 유지합니다. 상업용 박테리아 용해 키트를 사용하여 Borreliella burgdorferi 세포 펠릿에서 용해물을 준비합니다.프로테아제 억제제 없이 10 내지 15 밀리리터의 B-PER 용액에 펠릿을 재현탁시키고 용해가 얼음 상에서 5분 동안 진행되도록 한다. 용해 용액에 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하고 3 라운드의 초음파 처리를 진행하십시오. 이제 50 밀리리터 원심 분리 튜브를 사용하여 원심 분리 및 여과로 세포 용해물을 정화합니다.코발트 컬럼 로딩 버퍼를 용액에 추가하여 총 부피를 최대 30밀리리터로 만듭니다. 세포 파편을 20, 000배 G에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛화한다. 나중에, 0.45 마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 상청액을 여과하고, 용해물 및 코발트 컬럼 로딩 완충액을 1:10의 최종 희석 비율로 희석한다.제조업체의 지침에 따라 코발트 또는 니켈 수지 컬럼을 사용하여 정화된 세포 용해물 상청액에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행합니다. 분석을 위해 flow-through, wash 및 용출된 샘플을 저장합니다. 즉시 RNA 중합효소 용액 완충용액을 완충액 교환 컬럼을 사용하여 저장 완충용액과 제조사의 지시에 따라 교환한다.이어서, RNA 중합효소를 10-킬로달톤-컷오프 원심 필터 유닛을 사용하여 밀리리터당 0.2 내지 0.4 밀리그램의 농도로 농축시킨다. 분광 광도계로 농도를 결정하고 냉동 재고를 준비합니다. PCR 튜브에 20 내지 50 마이크로리터 부피의 RNA 중합효소 동결 스톡을 분취하고, 섭씨 영하 80도에서 RNA 중합효소를 저장한다.방사선 오염을 줄이기 위해 방사선 벤치를 포함한 작업 표면을 준비하십시오. 신선한 RNA 중합효소 및 RpoD 스톡을 얼음 상에서 해동하고, 피펫팅 전에 해동된 모든 냉동 스톡을 완전히 혼합하고, 실험 요건에 따라 방사성 동위원소 뉴클레오티드에 대한 별도의 NTP 혼합물에서 마스터 반응 혼합물을 준비한다. 실험 세트의 대조 반응을 PCR 튜브에 분주합니다.물, 반응 혼합물, RNA 중합효소 및 RpoD를 지정된 PCR 튜브에 분배한 후 피펫팅으로 시약을 혼합합니다. 준비된 물질을 방사선 벤치로 옮기고 알파-32P 표지된 ATP를 NTP에 첨가한 후 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다. 시험관내 전사 반응 혼합물을 함유하는 튜브에 NTP를 첨가하고, DNA 주형을 첨가하여 시험관내 전사 반응을 개시한다.부드럽게 피펫팅하여 반응 부피를 혼합하고 튜브를 섭씨 37도에서 열순환기 또는 열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 열순환기 또는 열 블록에서 반응을 제거하고 50% 포름아미드를 함유하는 동일한 부피의 2X RNA 로딩 염료를 반응 혼합물에 첨가하여 시험관 내 전사 반응을 중지합니다. 섭씨 65도에서 5분 동안 열순환기 또는 열 블록에서 반응을 배양하여 효소를 변성합니다.겔 전기영동을 사용하여 시험관내 전사된 RNA를 180볼트에서 30 내지 45분 동안 10%에서 15% TBE 우레아 폴리아크릴아미드 겔로 분리합니다. 비혼입 방사성 표지된 ATP를 함유하는 겔의 임의의 부분을 제거한 후, 겔을 포스포 스크린에 밤새 노출시키고, 포스포스크린 이미저를 사용하여 방사성 표지된 RNA를 이미지화한다. SDS-PAGE는 RNA 중합효소 복합체의 3개의 펩타이드인 RpoC, RpoB, RpoA에 해당하는 3개의 밴드를 나타내었다.MBP-태깅된 재조합 보렐리엘라 부르그도르페리 RpoD의 크기와 일치하는 115 킬로달톤의 펩티드가 또한 관찰되었다. 인자 XA 프로테아제와 단백질 혼합물의 절단은 RpoD 및 MBP의 두 가지 중요한 생성물의 생성을 유도했습니다. Borreliella burgdorferi FLGB의 프로모터 부위는 PCR에 의해 생성되었습니다.RpoD 농도의 2배 희석은 축적된 RNA 생성물의 더 낮은 수준을 발생시킨다. RNA 중합효소 농도가 낮으면 RpoD 농도 범위에서 더 적은 수의 RNA 생성물을 얻을 수 있습니다. 밀도 측정 신호는 두 실험에서 반응에 존재하는 RpoD의 양 사이의 선형 관계를 나타냅니다.RNA 중합효소 활성은 정제, 저장 및 실험 과정 동안 다양한 인자에 민감합니다. 좋은 계획과 함께 신선한 효소와 시약은 이 프로토콜에서 성공할 수 있는 최고의 기회를 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

체외 방법에서 대상 바인딩 및 치료 항체 사이 CDC 유도 비교 : 응용 프로그램 생물학적 동등성 분석에

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...